超聲空化聯(lián)合恩度抑制大鼠Walker-256腫瘤血管新生

余堰瀾，喬 偉，馮 爽，黃蕾丹，張 毅，劉 政

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科，重慶 400037)

腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成。抗腫瘤血管生成治療通過破壞和抑制腫瘤新生血管生成，達到抑制腫瘤生長的目的[1]。前期實驗[2]發(fā)現(xiàn)，微泡增強超聲空化在高聲壓(>4 MPa)水平能物理毀損腫瘤微血管，阻斷腫瘤血流可達24 h，故可能成為抗血管生成的物理治療方法，但不能阻止腫瘤血管在24 h后逐步恢復(fù)血供，導(dǎo)致單獨微泡超聲空化治療效果并不理想。內(nèi)皮抑素是迄今最有效的血管生成抑制因子之一，能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移與血管生成[3]。恩度是人內(nèi)皮抑素的重組蛋白，也是我國批準用于治療小細胞肺癌的一線化學(xué)治療藥物[4]。抗腫瘤血管生成藥以腫瘤新生血管為靶點，單獨使用療效有限[5]，聯(lián)合治療已成為趨勢。本研究通過觀察腫瘤血流灌注變化和生長抑制情況，評價腫瘤血流物理阻斷聯(lián)合抗血管生成藥物的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 索尼克脈沖式超聲空化治療儀(CZ-960)，治療頭采用弱聚焦圓形換能器，中心頻率為830 kHz,脈沖寬度為400個周期，脈沖重復(fù)頻率9 Hz，峰值負壓為4.3 MPa，占空比為0.22%，工作6 s間歇6 s,總輻照時間為6 min。飛依諾彩色多普勒超聲診斷儀(VINNO70)，X4-12L高頻線陣探頭(頻率范圍4～12 MHz)。超聲造影(contrast-enhanced ultrasound， CEUS)采用CBI(contrast B imaging)造影模式，機械指數(shù)為0.08。注射用GE全氟丁烷微球(Sonazoid，16μl/支)，平均直徑為2.1 μm，微球外殼厚度2～3 nm，以4 ml無菌生理鹽水復(fù)溶16 μl微球，充分震蕩混勻后微球溶液濃度約6×108/ml。重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(恩度，15 mg∶3 ml，2.4×105U/支，山東先聲麥得津生物制藥有限公司)。

1.2 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠40只(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗中心提供)，體質(zhì)量180～200 g。

1.3 建立模型 將人乳腺癌肉瘤Walker-256細胞(中科院醫(yī)學(xué)藥物研究所提供)培養(yǎng)于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)液移入離心管，以1 000 rot/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液。磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整細胞濃度至約1×107/ml。隨機選取大鼠一側(cè)大腿內(nèi)側(cè)備皮、消毒，取細胞懸液0.2 ml接種于皮下。

1.4 實驗動物分組及處理 經(jīng)超聲測量腫瘤生長至最大徑約1.0 cm入組，將荷瘤大鼠隨機分為4組，每組10只，施以相應(yīng)干預(yù)。A組：微泡+超聲輻照+恩度；B組：恩度；C組：微泡+超聲輻照；D組：超聲假照。以30 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，仰臥保定于實驗臺上，建立尾靜脈通道；腫瘤生長處備皮后充分暴露。造影結(jié)束后，對A組注射恩度溶液5 mg/kg體質(zhì)量，隨后對腫瘤區(qū)域進行超聲輻照5 min，同時緩慢注射微球稀釋液(0.08 ml微球溶液均勻混合于1 ml生理鹽水)，注射結(jié)束后跟注0.5 ml生理鹽水沖管；B組注射同量恩度后注射1.5 ml生理鹽水；C組給予超聲輻照并注射微球稀釋液；D組注射1.5 ml生理鹽水，將治療探頭置于腫瘤區(qū)域但不進行輻照。上述過程每天1次，連續(xù)3天。

之后經(jīng)尾靜脈團注0.04 ml微球溶液，隨后推注0.5 ml生理鹽水沖管，行CEUS并儲存圖像。以超聲診斷儀自帶造影分析軟件對各組腫瘤動態(tài)造影影像進行定量分析。參考二維聲像圖勾畫腫瘤ROI(圖1),以時間-強度曲線(time intensity curve, TIC)獲得峰值強度(peak intensity, PI)與曲線下面積(area under curve, AUC)。

1.6 組織病理檢查 末次造影結(jié)束后處死動物，取材剝離腫瘤組織，固定、石蠟包埋后切片，行血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A， VEGFA)免疫組化染色，以光學(xué)顯微鏡(×100)篩選染色最密集區(qū)，即“熱區(qū)”，隨后于高倍鏡(×400)下隨機計數(shù)3個視野內(nèi)微血管數(shù)，取平均值作為腫瘤微血管密度(microvessel density， MVD)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件。PI、AUC、腫瘤體積均符合正態(tài)分布，以±s表示。以單因素方差分析比較各組MVD、PI、AUC及腫瘤體積差異，LSD法進行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEUS定量指標 干預(yù)前造影顯示各組腫瘤內(nèi)部灌注良好，無明顯充盈缺損，各組PI及AUC差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。干預(yù)結(jié)束后1天，A、B、C組腫瘤中心區(qū)域可見充盈缺損區(qū)，而D組腫瘤仍充盈較好； PI和AUC在A組顯著低于其余3組(P均<0.05)，B組和C組較D組降低(P均<0.05)。干預(yù)后4天，A組腫瘤充盈缺損區(qū)仍然存在，而C組可見部分血流恢復(fù)，A組PI和AUC比其余3組明顯降低(P均<0.05)，見表1。

2.2 腫瘤體積 干預(yù)前各組腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。干預(yù)后1天，A組腫瘤體積明顯低于其余3組(P均<0.05)，B組和C組明顯低于D組(P均<0.05)。干預(yù)后4天，A組腫瘤體積仍明顯低于其余3組(P均<0.05)，B組也略低于D組(P<0.05)，見表2。

2.3 病理檢查 干預(yù)后4天，鏡下觀察A組、B組微血管數(shù)量少于C組和D組(圖2)。腫瘤組織MVD存在差異(F=30.121,P<0.001)，A組(18.33±3.10)、B組(24.17±2.16)明顯低于C組(30.43±4.17)和D組(31.57±1.74)(P均<0.05)，A組與B組、C組與D組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

微泡增強超聲空化治療利用低強度、高聲壓、脈沖式治療超聲激勵超聲造影劑微泡，使之發(fā)生空化效應(yīng)，從而產(chǎn)生治療效應(yīng)[6]。微泡超聲空化可毀損阻斷腫瘤微血管，重復(fù)性空化治療可明顯抑制腫瘤生長，但需每72 h重復(fù)一次，整個周期重復(fù)10次以上，時間長達30天[7]，且腫瘤血流阻斷后，乏氧狀態(tài)會刺激各種血管生長因子大量釋放，促進血管新生[8]。超聲空化聯(lián)合抗腫瘤血管生成藥物治療或許有所幫助。目前綜合治療模式已被證實為治療惡性腫瘤的有效方法。

已有研究[9-11]表明聲孔效應(yīng)可增強化療藥物的療效。LUO等[12]證實超聲輻照阿霉素載藥微泡能介導(dǎo)細胞凋亡和拮抗新生血管生成而抑制腫瘤。HUA等[13]以超聲激勵諾帝(一種誘導(dǎo)分化的抗腫瘤藥物)載藥微泡發(fā)生空化效應(yīng)，對兔VX2腫瘤微循環(huán)的顯著阻斷效應(yīng)。JING等[14]發(fā)現(xiàn)超聲空化聯(lián)合恩度載藥微泡對裸鼠乳腺癌腫瘤有阻斷腫瘤微循環(huán)、抑制腫瘤生長的作用。但由于以氣體為核心的微泡只有膜表面載藥，空間有限，且載藥量和包埋率往往很低，藥物進入循環(huán)后，由于血液稀釋而濃度明顯降低，同時可能未達靶點就提前釋藥；且載藥微泡的研發(fā)周期漫長[15]。

表1 各組Walker256荷瘤模型大鼠CEUS定量指標(±s)

表1 各組Walker256荷瘤模型大鼠CEUS定量指標(±s)

組別PI(dB)干預(yù)前干預(yù)后1天干預(yù)后4天AUC(dB·s)干預(yù)前干預(yù)后1天干預(yù)后4天A組129.39±7.8989.40±8.3081.76±8.267206.54±337.745277.77±171.194608.27±472.94B組124.22±8.47115.18±7.4799.00±8.077058.72±320.476285.10±499.775620.82±338.28C組129.32±7.93111.30±7.11102.31±5.617145.41±148.266142.73±256.385851.94±308.83D組131.03±6.26126.92±5.63108.09±8.497088.92±207.936793.50±176.155993.51±311.50F值1.47829.10924.4371.17729.29923.279P值0.237<0.001<0.0010.759<0.001<0.001

圖1 大鼠Walker-256腫瘤二維及CEUS表現(xiàn) A.二維聲像圖顯示; B.CEUS顯示腫瘤，白色區(qū)域為ROI; C.TIC

圖2 干預(yù)后各組腫瘤MVD(VEGFA，×400) A.A組； B.B組； C.C組； D.D組

表2 各組Walker-256荷瘤模型大鼠干預(yù)前后腫瘤體積比較(cm3，±s)

表2 各組Walker-256荷瘤模型大鼠干預(yù)前后腫瘤體積比較(cm3，±s)

組別干預(yù)前干預(yù)后1天干預(yù)后4天A組0.53±0.181.94±0.645.25±1.74B組0.52±0.174.71±1.3811.23±1.80C組0.55±0.164.94±1.5414.61±2.87D組0.54±0.187.47±1.2314.82±3.25F值0.05832.93231.846P值0.989<0.001<0.001

超聲空化聯(lián)合經(jīng)靜脈抗血管生成治療操作相對簡單，不僅可借聲孔效應(yīng)從靜脈釋放大量藥物，而且二者均以腫瘤微血管作為治療靶點，超聲空化阻斷腫瘤血流聯(lián)合恩度治療可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

本研究結(jié)果證實超聲空化聯(lián)合恩度可顯著抑制腫瘤生長。本研究采用高峰值負壓(4.3 MPa)脈沖式輻照超聲激勵微泡，空化機械效應(yīng)強烈，易造成腫瘤微血管毀損。施加干預(yù)后1天，A、B、C組PI和AUC均顯著下降，且A組最低；干預(yù)后4天，A組PI和AUC仍在4組中處于最低水平，提示超聲聯(lián)合恩度治療能在4天內(nèi)維持腫瘤循環(huán)阻斷或低灌注狀態(tài)，可能是恩度抑制血管新生所致。此時A組腫瘤體積低于其他3組，而B組低于C、D組，且A組腫瘤組織MVD最低，提示超聲空化聯(lián)合恩度具有協(xié)同效應(yīng)，可通過維持腫瘤低灌注狀態(tài)和阻斷新生血管生成而產(chǎn)生更為顯著的腫瘤生長抑制作用。

本研究以VEGFA為測定MVD的靶點，初步探討微泡激勵超聲空化效應(yīng)聯(lián)合恩度抑制腫瘤生長的機制。與D組相比，A、B組MVD明顯降低，而C組無明顯差異，提示單純聲空化治療后腫瘤微血管并未得到顯著抑制，而微泡超聲空化聯(lián)合恩度表現(xiàn)則出一定的抗腫瘤血管生成的協(xié)同作用，推測其可能機制是恩度在超聲空化機械毀損腫瘤微血管并阻斷腫瘤血流的基礎(chǔ)上發(fā)揮了抑制腫瘤血管新生的作用。

本實驗的主要局限性：未能準確測定外周血及腫瘤局部藥物濃度；觀察腫瘤僅持續(xù)到干預(yù)后4天；空化效應(yīng)聯(lián)合恩度抑制腫瘤新生血管生成的機制有待進一步探討。

綜上所述，微泡激勵超聲空化聯(lián)合恩度可在4天內(nèi)顯著減少Walker-256荷瘤大鼠腫瘤組織內(nèi)部血流灌注，抑制新生血管生成，從而減緩腫瘤生長，有望為綜合治療腫瘤提供新的思路。