嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ的高效分泌表達及其酶學性質

曾 靜,郭建軍,袁 林

(江西省科學院微生物研究所,江西南昌 330096)

淀粉是自然界含量豐富的高分子聚糖,是各種生物的重要能量來源,也是一種重要的工業原材料[1-2]。在淀粉酶法制糖工業中,淀粉首先經過α-淀粉酶水解,淀粉內部的α-1,4-糖苷鍵被隨機切斷,淀粉由高聚糖水解為低聚糖,該過程稱為液化步驟[3-4]。液化步驟產生的低聚糖隨后在β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶以及普魯蘭酶的作用下,殘留的支鏈α-1,6-糖苷鍵和直鏈α-1,4-糖苷鍵被進一步水解,最終形成葡萄糖漿,該過程稱為糖化步驟[5-6]。淀粉的液化步驟在95～105 ℃、pH6.0下進行,糖化步驟條件則通常為60 ℃、pH4.5～5.5,由液化轉入糖化時需要降低溫度并加酸降低糖漿的pH,并且糖化過程中使用了多種水解酶[7-9]。這些因素使得淀粉制糖的生產成本增加,同時降低了生產效率。若某種淀粉酶在液化條件下可以同時進行糖化,則既可以省去加酸堿調節pH的過程以簡化工藝、降低成本,又可以有效地防止微生物污染,并且在液化的高溫下,還可以獲得較高的反應速率。因此,人們希望將液化過程和糖化過程合并,能夠獲得一種在液化條件下具有較強的水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵能力的淀粉酶。

來源于極端嗜熱古生菌Thermococcuskodakarensis的嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL是同時具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的雙功能酶[10-13]。Tk-PUL是目前報道的水解活性最高的普魯蘭水解酶Ⅲ,并且Tk-PUL的酶學性質(如熱穩定、低pH、不依賴于Ca2+)使得其適用于淀粉酶法制糖工業[14]。Tk-PUL可同時水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵,能夠在高溫的液化條件下進行糖化作用,可使淀粉制糖的糖化過程和液化過程合二為一,大大降低淀粉酶法制糖工業的生產成本,并提高生產效率。因此,嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL在淀粉酶法制糖工業中具有巨大的應用潛力。目前Tk-PUL已在大腸桿菌表達系統中進行表達,重組Tk-PUL主要位于胞內可溶成分中,從重組大腸桿菌中獲取Tk-PUL的純化過程復雜。另外大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌,其外膜成分中含有脂多糖。脂多糖會對人和動物的健康產生不利影響,食品和制藥工業的最終產品中不能含有脂多糖,而去除脂多糖使得下游純化過程變得復雜,同時也增加了重組酶的生產成本。因此,為利于Tk-PUL在制糖工業中的應用,需選用其他合適的表達系統來獲取重組Tk-PUL。枯草芽孢桿菌作為傳統的工業生產菌株,具有分泌表達能力強、培養條件和基因操作簡單、發酵工藝成熟等優點,被認為是理想的外源蛋白質的分泌表達宿主菌[15-17]。利用枯草芽孢桿菌表達系統的優越性,同時結合其自身信號肽,構建分泌表達系統,可以實現外源蛋白質的分泌表達。

本研究通過構建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達系統中的信號肽篩選庫,并結合高通量篩選方法,實現Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達系統中的高效分泌表達。在此基礎上,對Tk-PUL的酶學性質進行初步研究,為其在淀粉酶法制糖工業中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisRIK1285、重組質粒pET26b-tkpul 由本實驗室保存;LB培養基:蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 L 環凱生物科技有限公司;KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司;DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker 美國Fermentase公司;DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國Omega Bio-tek公司;BacillussubtilisSecretory Protein Expression System Cat.#3380(枯草芽孢桿菌蛋白質分泌表達試劑盒Cat.#3380)、In-Fusion? HD Cloning kit(In-Fusion? HD克隆試劑盒) 日本Takara公司;Chelating SepharoseTMFast Flow、Chelating SepharoseTMFast Flow 美國GE Healthcare公司;Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;實驗所用試劑(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

Mastercycler gradient PCR儀 美國Eppendorf公司;TY04S-3C凝膠成像系統 北京君意東方電泳設備有限公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;SP-752PC紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Agilent 7500ce 美國Agilent公司;iMark 酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子克隆技術和表達產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析 分子克隆技術和表達產物的SDS-PAGE分析參照文獻[18]進行。

1.2.2 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選庫的構建 基于tkpul的堿基序列,設計引物P1和P2(表1),以重組質粒pET26b-tkpul為模板,擴增基因tkpul中不含信號肽的結構基因tkpulds。PCR擴增條件為:98 ℃變性5 min;98 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,74 ℃延伸2 min,30個循環;74 ℃延伸10 min。擴增產物經NdeI和XbaI雙酶切,連接至載體pBE-S,構建重組質粒pBE-S-tkpulds。按照BacillussubtilisSecretory Protein Expression System Cat.#3380(枯草芽孢桿菌蛋白質分泌表達試劑盒Cat.#3380)的說明書設計引物M1和E1(表1),以重組質粒pBE-S-tkpulds為模板,進行PCR擴增,實現重組質粒pBE-S-tkpulds的線性化。采用In-Fusion? HD Cloning kit(In-Fusion? HD克隆試劑盒)連接線性化DNA和枯草芽孢桿菌蛋白質分泌表達試劑盒中SP DNA混合物,并將連接產物轉化枯草芽孢桿菌蛋白質分泌表達試劑盒中StellarTM感受態細胞,將轉化產物全部涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上,于37 ℃過夜培養。收集LB固體平板上所有轉化子,提取其中所含重組質粒。將所獲得的重組質粒轉化BacillussubtilisRIK1285,BacillussubtilisRIK1285感受態細胞的制備和轉化采用改進的Spizizen法[19]進行。將轉化子涂布于含10 μg/mL卡那霉素的LB固體平板上,于37 ℃過夜培養,即獲得Tk-PUL分泌表達信號肽篩選庫。

表1 構建重組質粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

注:下劃線標注的部分為限制性酶切割位點。

1.2.3 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選庫的高通量培養 取滅菌、烘干的96孔深孔板,每孔加入LB培養基500 μL。用10 μL移液槍扎取槍頭后挑取單菌落,轉移到培養孔中輕輕洗吹幾次,棄掉槍頭,依次反復直至挑選結束。蓋上蓋子,于搖床中37 ℃、230 r/min過夜活化。用 8通道移液器按照順序將活化后的種子液轉接至48 孔深孔板中,接種量為3%。蓋上蓋子,搖床中37 ℃、230 r/min開始發酵,培養時間為30 h。

1.2.4α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測 將發酵后的48 孔深孔板于4 ℃下4000 r/min離心10 min,離心后的上清用于α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測。取滅菌、烘干的96孔深孔板,每孔加入100 μL發酵液上清,然后加入100 μL反應底物(1%可溶性淀粉或1%普魯蘭糖),于100 ℃反應10 min后,向其中補加300 μL DNS[20]并沸水浴反應10 min后，轉移至冰水浴中快速冷卻。取潔凈的酶標板加入150 μL無菌水和50 μL反應液并混勻,用酶標儀測定540 nm下的吸光值[10]。吸光值的大小反映胞外Tk-PUL分泌量的多少。

1.2.5 Tk-PUL分泌表達信號肽的鑒定 選取Tk-PUL分泌表達信號肽，篩選庫中α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性均較高的克隆子,設計引物P3和P4(表1)進行菌落PCR,并將獲得的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序,將測序結果在NCBI網站上進行Blast搜索,確定每個克隆子所對應的信號肽名稱。

1.2.6 Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達系統中的分泌表達和純化 接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養基中,用250 mL三角瓶進行培養,其中培養基的裝液量為20 mL,培養溫度為37 ℃,轉速為200 r/min,培養時間為10 h。然后轉接該培養物于新鮮LB液體培養基中,用250 mL三角瓶進行培養,其中培養基的裝液量為25 mL,接種量為3%,培養溫度為37 ℃,轉速為200 r/min,培養時間為30 h。

采用Ni2+親和層析柱對發酵上清液中目的蛋白質進行純化,用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測重組酶的純度,采用活性印記分析[21]檢測重組酶的α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活,并采用Bradford法[22]測定重組酶的濃度。

1.2.7 Tk-PUL的酶學性質分析

1.2.7.1α-淀粉酶活性測定和普魯蘭酶活性測定 將10 μL純化后酶液與190 μL 含1%(W/V)可溶性淀粉或普魯蘭糖的50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液混合,于100 ℃反應10 min后,用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定反應體系中還原糖量。酶活力單位(U)定義:在一定反應條件下,每分鐘催化產生1 μmol還原糖的酶量為一個U。

1.2.7.2 酶的最適反應pH測定 將酶液與不同pH的底物混合,于100 ℃下測定不同pH下α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活。將所測得的最高酶活定義為100%,并以相對酶活的百分比對pH作圖,確定其最適反應pH。采用不同緩沖液配制不同pH的底物:50 mmol/L MES(pH3.0～7.0)、50 mmol/L MOPS(pH7.0～9.0)。

1.2.7.3 酶的最適反應溫度測定 按照上述反應體系混合酶液和底物,分別于40～110 ℃反應10 min,測定不同溫度下α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活,并以對比酶活力溫度作圖,確定其最適反應溫度。其中,40～95 ℃范圍內的反應于水浴中進行,100～110 ℃范圍內的反應于甘油浴中進行。高溫條件下測定酶活性時,反應樣品置于O型環螺旋蓋密封管內,以防止水分蒸發。

1.2.7.4 酶的熱穩定性測定 在50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液中,酶液于100 ℃保溫,分時間梯度取出部分樣品,根據如上反應體系測定α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將未處理的酶液的酶活定義為100%,并以相對酶活的百分比對時間作圖,評價酶的熱穩定性。

1.2.7.5 酶的動力學常數測定 用50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液配制不同濃度的底物,分別向不同濃度底物中加入等量的酶液,按照如上反應體系測定酶活。根據雙倒數作圖法以底物濃度的倒數為橫坐標,以比酶活力的倒數為縱坐標作圖,直線的斜率為Km/Vmax,截距為1/Vmax,計算以可溶性淀粉為底物時的米氏常數Km、最大反應速度Vmax和反應常數kcat。可溶性淀粉的濃度梯度設定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL;普魯蘭糖的濃度梯度設定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選庫的高通量篩選

枯草芽孢桿菌是理想的外源蛋白質的分泌表達宿主菌[16],外源蛋白質在枯草芽孢桿菌表達系統中的分泌表達依賴于枯草芽孢桿菌信號肽的引導,并且信號肽與外源蛋白質之間存在適配性。因此針對特定的蛋白質需要選擇合適的信號肽來實現有效地分泌表達[23-25]。目前尚無法預測哪種信號肽能夠高效引導目的蛋白質分泌到胞外,只能通過實驗手段從大量信號肽中篩選得到高效引導目的蛋白質分泌到胞外的信號肽。

本研究基于以下三點探索了Tk-PUL在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達的條件:首先構建了引導Tk-PUL分泌表達的信號肽篩選庫;其次將搖瓶的發酵參數引入至深孔板水平,建立了基于深孔板的高通量培養技術;再次將常規的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性測定方法移植于96孔深孔板中,建立了α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測方法,并與高通量培養技術偶聯建立了信號肽篩選庫的高通量篩選方法。

本研究構建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達系統中分泌表達的信號肽篩選庫,共獲得475個克隆子,對這475個克隆子進行胞外上清液的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測,實現信號肽篩選庫的初篩。從以上475克隆子選取其中酶活較高的50個克隆子,并對其進行復篩,這50個克隆子的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測結果如圖1～圖5所示。對于1～50號克隆子,其α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性之間存在一定的倍數關系,普魯蘭酶活性約為α-淀粉酶活性的2倍。此外,30號克隆子具有最高的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,這表明30號克隆子的胞外重組酶分泌量最高。選取胞外上清液α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性較高的克隆子進行信號肽的進一步鑒定。

圖1 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選克隆子的 酶活檢測結果(1～10號克隆子)Fig.1 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 1～10)

圖2 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選克隆子的 酶活檢測結果(11～20號克隆子)Fig.2 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 11～20)

圖3 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選克隆子的 酶活檢測結果(21～30號克隆子)Fig.3 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 21～30)

圖4 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選克隆子的 酶活檢測結果(31～40號克隆子)Fig.4 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 31～40)

圖5 Tk-PUL分泌表達信號肽篩選克隆子的 酶活檢測結果(41～50號克隆子)Fig.5 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 41～50)

2.2 Tk-PUL分泌表達信號肽的鑒定

從Tk-PUL分泌表達信號肽篩選庫中選取酶活高的10個克隆子(9號、10號、20號、29號、30號、39號、40號、48號、49號、50號),采用引物P3和P4進行菌落PCR,并將獲得的DNA片段(如圖6所示)送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序,將測序結果在NCBI網站上進行Blast搜索,確定每個克隆子所對應的信號肽名稱。其中9號克隆子對應的信號肽為BglC,10號和30號克隆子對應的信號肽為AmyE,20號、39號和48號克隆子對應的信號肽為Mpr,29號克隆子對應的信號肽為NprE,40號、49號和50號克隆子對應的信號肽為Bpr。結合以上克隆子的胞外α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測結果,即30號克隆子具有最高的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,10號克隆子次之,可以得出以下結論:針對于Tk-PUL,信號肽AmyE的引導分泌效率最高。

圖6 信號肽篩選克隆子的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of signal peptide screening clones

注:M. DL2000 ladder;1.9號克隆子;2.10號克隆子;3.20號克隆子;4.29號克隆子;5.30號克隆子;6.39號克隆子;6.40號克隆子;8.48號克隆子;9.49號克隆子;10. 50號克隆子;11.轉化重組質粒pBE-S-tkpulds的重組枯草芽孢桿菌。

2.3 重組Tk-PUL的分泌表達與純化

接種30號克隆子的單克隆到LB液體培養基中,用250 mL三角瓶進行培養,其中培養基的裝液量為20 mL,培養溫度為37 ℃,轉速為230 r/min,培養時間為10 h。然后轉接該培養物于新鮮LB液體培養基中,用250 mL三角瓶進行培養,發酵培養時間為30 h。待發酵結束后,對發酵上清液進行α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測。酶活測定結果顯示,重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力為29.1 U/mL,胞外普魯蘭酶活力為53.5 U/mL。

采用Ni2+親和層析柱對發酵上清液中目的蛋白質進行純化,用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測重組酶的純度,并采用活性印記分析檢測重組酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,結果如圖7所示。Tk-PUL的分子量約為86 kDa,并且活性印記分析結果顯示Tk-PUL能夠降解可溶性淀粉和普魯蘭糖,即Tk-PUL同時具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。

圖7 Tk-PUL的SDS-PAGE檢測以及活性印記分析Fig.7 SDS-PAGE and activity staining analysis of Tk-PUL

注:M:蛋白質Marker;1:Tk-PUL的SDS-PAGE檢測;2:Tk-PULα-淀粉酶活性的活性印記分析;3:Tk-PUL普魯蘭酶活性的活性印記分析。

2.4 重組Tk-PUL的酶學性質研究

2.4.1 pH對重組Tk-PUL相對酶活的影響 將酶液與不同pH(3.0～9.0)的1%(W/V)可溶性淀粉溶液或普魯蘭糖溶液混合,于100 ℃下測定重組Tk-PUL的相對α-淀粉酶活性或普魯蘭酶活性,結果如圖8所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時,Tk-PUL的最適反應pH均為4.5,并且在pH3.5～8.0范圍內均具有50%以上相對酶活。

圖8 pH對酶活的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 溫度對重組Tk-PUL的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的影響 以1%可溶性淀粉或1%普魯蘭糖為底物,于不同溫度條件下(40～110 ℃)測定重組Tk-PUL的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力,結果如圖9所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時,重組Tk-PUL的最適反應溫度均為100 ℃。在40～110 ℃間Tk-PUL的普魯蘭酶比活力均明顯高于α-淀粉酶比活力。其中,在100 ℃條件下,Tk-PUL的α-淀粉酶比活力為54.08 U/mg,普魯蘭酶比活力比活力為110.39 U/mg。

圖9 溫度對酶活的影響Fig.9 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.3 重組Tk-PUL的熱穩定性 重組Tk-PUL于100 ℃下的熱穩定性測定結果如圖10所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時,重組Tk-PUL于100 ℃、pH4.5的半衰期均約為2 h。即Tk-PUL的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性于100 ℃的半衰期均約為2 h。

圖10 100 ℃重組Tk-PUL的熱穩定性Fig.10 Thermal stability of recombinant Tk-PUL at 100 ℃

2.4.4 重組Tk-PUL的動力學參數 重組Tk-PUL以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時的米氏常數Km和反應常數kcat如表2所示。以可溶性淀粉為底物時,Tk-PUL的Km值為1.86 mg/mL,kcat值為80.9 s-1;以普魯蘭糖為底物時,Tk-PUL的Km值為2.07 mg/mL,kcat值為157.8 s-1。Tk-PUL對可溶性淀粉和普魯蘭糖的Km值相近,即Tk-PUL對可溶性淀粉和普魯蘭糖的結合能力基本一致;Tk-PUL對普魯蘭糖的kcat值約為其對可溶性淀粉的kcat值的2倍,即Tk-PUL以普魯蘭糖為底物時的反應速率明顯高于以可溶性淀粉為底物時的反應速率。

表2 100 ℃重組Tk-PUL的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of recombinant Tk-PUL at 100 ℃

3 結論

本研究通過構建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達系統中分泌表達的信號肽篩選庫并結合高通量篩選技術,確定引導Tk-PUL在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達的信號肽為AmyE。在信號肽AmyE的引導下,重組Tk-PUL在重組枯草芽孢桿菌中高效分泌表達,重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力為29.1 U/mL,胞外普魯蘭酶活力為53.5 U/mL。并且枯草芽孢桿菌表達系統中分泌表達獲得的重組Tk-PUL的酶學性質與大腸表達系統中胞內表達獲得的重組Tk-PUL的酶學性質[9-10]基本一致。以可溶性淀粉為底物時,重組Tk-PUL的最適反應pH為4.5,最適反應溫度為100 ℃,對應的絕對酶活為54.08 U/mg,動力學常數Km值為1.86 mg/mL,kcat值為80.9 s-1,于100 ℃、pH4.5的半衰期約為2 h。以普魯蘭糖為底物時,重組Tk-PUL的最適反應pH為4.5,最適反應溫度為100 ℃,對應的絕對酶活為110.39 U/mg,動力學常數Km值為2.07 mg/mL,kcat值為157.8 s-1,于100 ℃、pH4.5的半衰期約為2 h。本研究結果表明,在信號肽AmyE的引導下,嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL可在枯草芽孢桿菌表達系統中高效分泌表達,這為Tk-PUL在淀粉酶法制糖工業中的應用奠定了基礎。此外,由Tk-PUL的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性具有相似的最適反應溫度、最適反應pH及熱穩定性可以推斷,Tk-PUL的這兩種酶活性是由同一活性中心催化的。即Tk-PUL屬于單結構域雙功能酶,為探索雙功能酶結構與功能之間的關系提供了很好的研究素材。