雙響應面法結合Matlab法優化葡萄籽多酚提取工藝及羥自由基清除率評價

薛 山,2,肖 夏3,陳舒怡,劉伯虎,蘭國錦

(1.閩南師范大學生物科學與技術學院,福建漳州 363000; 2.菌物產業福建省高校工程研究中心,福建漳州 363000; 3.四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000)

葡萄是世界范圍內種植及銷量最大的水果之一,其營養豐富、生物活性高,其中約13%用于鮮食,80%用于釀酒,7%用于其它副產品加工[1]。以葡萄酒釀造為例,加工之后會產生大量的葡萄皮渣、葡萄籽、以及葡萄梗,可占據釀酒葡萄總量的20%[2]。其中,葡萄籽提取物(Grape seed extract,GSE)中含有豐富的多酚類、礦質元素、蛋白質、氨基酸、維生素等,具有潛在的開發價值[3-4]。據報道,葡萄籽中的活性多酚現已應用于食品、藥品和保健品[1]。與此同時,葡萄籽多酚的提取利用還有利于實現廢棄物綜合利用,減少環境污染[5-6]。

目前,葡萄皮渣中多酚的提取雖已有多種方法,如酶法、超聲輔助法、溶劑萃取法等[7],但考慮到擴大生產規模的局限性仍多采用溶劑提取法[8]。同時,諸多研究顯示,在有機試劑中,丙酮有著較高的葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)提取率,且丙酮提得的GSP具有較優的抗氧化活性[8-10]。經成分鑒定,葡萄籽中含有沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素等活性酚類[11-13],具有抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、抗炎癥[16]、保護心臟[17]、降血脂[18]等多種生理功效。

國內外已有不少學者對GSP的提取工藝進行了研究,但是多為僅僅基于酚類物質提取率的單因素及響應面優化[19-20],罕見Matlab的優化研究。Matlab是國際上最優秀的科技應用軟件之一,具有強大的科學計算功能,并提供了專門的優化工具箱,通過建立研究問題的數學模型,編寫程序代碼,有效計算出最優解,已廣泛應用于各研究領域[21],如化工油脂提取優化[22],本文擬采用Box-Behnken雙響應面優化法結合Matlab分析法對GSP進行提取工藝優化,擬為葡萄籽的加工利用研究提供理論依據與創新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒新疆山葡萄籽(干品) 大閩食品(漳州)有限公司提供;甲醇、無水乙醇、丙酮、無水碳酸鈉、沒食子酸標準品 分析純,西隴科學股份有限公司;福林酚試劑 北京索寶生物科技有限公司。

AR124CN電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;DGG-9140B電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;FW100高速萬能粉粹機 天津市泰斯特儀器有限公司;HH-2數顯電子恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;TGL-20M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;UV5100B紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GSP的提取 將葡萄籽粉碎,過40目篩,用石油醚脫脂后,自然揮干溶劑,于4 ℃冷藏備用。準確稱取1.00 g樣品于100 mL離心管中,按照一定的料液比加入適量體積的溶劑,于冰浴1000 W的超聲波發生儀超聲一定時間,之后激烈攪拌提取一定時間。然后在2500×g下離心10 min,收集上清液,殘渣重復提取一次,合并上清液并在45 ℃下旋轉濃縮到合適體積,用蒸餾水定容于25 mL待測[23]。

1.2.2 GSP含量測定 采用福林酚比色法,參考梁強[24]和Chu等[25]方法。在10 mL試管中,加入0.2 mL的多酚樣品提取液,用0.8 mL的蒸餾水稀釋,隨后加入0.2 mL的福林酚試劑,混合均勻。放置6 min后,加入2 mL 7%的碳酸鈉溶液,最后用蒸餾水補足5 mL,并在室溫下反應90 min,于波長760 nm處測定吸光值A。以沒食子酸為標準品,用蒸餾水稀釋不同濃度后繪制標準曲線,得到回歸方程:y=0.093x-0.002,R2=0.9995,y為吸光值,x為標準沒食子酸溶液濃度。GSP的提取量用沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 羥自由基清除率測定 在10 mL比色試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L的水楊酸溶液1.0 mL、待測液1.0 mL,8.8 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL,搖勻,37 ℃水浴30 min,于510 nm處測其吸光度,平均值記為Ai。另用蒸餾水代替H2O2溶液重復上述試驗,測得參比吸光度Ab;另用蒸餾水代替樣品溶液重復上述試驗,測得空白吸光度A0[26]。羥自由基清除率按下試計算:

1.2.4 單因素實驗 分別以不同提取介質、溶劑濃度、料液比、提取時間為單因素進行實驗,探究各因素對GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.1 不同提取介質對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱取粉碎過40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,料液比1∶30 g/mL,提取時間90 min條件下探究不同提取介質(水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮)對GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.2 不同濃度溶劑對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱取粉碎過40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質為丙酮,料液比1∶30 g/mL,提取時間90 min條件下探究不同丙酮濃度(60%、70%、80%、90%、100%)對GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.3 料液比對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱取粉碎過40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質為80%丙酮,提取時間90 min條件下探究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.4 提取時間對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱取粉碎過40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質為80%丙酮,料液比1∶40 g/mL條件下探究不同提取時間(30、60、90、120、150 min)對GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.5 響應面試驗 根據單因素實驗結果,確定提取液為丙酮,根據Box-Behnken設計的自變量,以GSP提取量和羥自由基清除率為雙響應值,進行提取條件優化。響應面分析因素和水平表見表1。

表1 響應面分析因素和水平表Table 1 TheTable of factors and levels used in response surface analysis

1.2.6 最優組合驗證試驗 依據Box-Behnken雙響應面結果,得到最優工藝條件,并進行驗證試驗。

1.2.7 Matlab優化試驗設計 利用Matlab軟件,采用優化計算方法以及算法語言的圖形處理功能,通過編制程序M(程序代碼),計算出溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)對GSP提取量(y1)和羥自由基清除率(y2)的四維及三維交互影響結果。

1.3 數據處理

每組處理重復3次,數據結果用均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 24.0軟件對結果進行單因素顯著性分析,P<0.05表示結果顯著,標示為不同字母。利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行響應面優化實驗,利用Matlab(MATrix LABoratory)軟件進行交互試驗數據計算及四維、三維繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同溶劑對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖1可知,在相同的提取條件下,80%的丙酮溶液的多酚提取量顯著高于其他溶劑(P<0.05),80%乙醇與80%甲醇的提取效果差異不顯著(P>0.05),而純水的多酚提取量最少。從自由基清除率來看,80%丙酮提取物的活性也顯著高于其他提取介質組(P<0.05)。據報道,有機溶劑能夠較高效的提取黃酮醇類、黃烷-3-醇類、芪類多酚等活性成分[10],其中,丙酮對葡萄籽原花青素的提取效果較甲醇和乙醇更優,且70%丙酮GSP提取物的抗氧化活性最高[8]。據劉進杰等[27]報道,采用甲醇、乙醇、丙酮和酸性水4種溶劑分別提取葡萄皮多酚時,丙酮提取物多酚得率最高、總還原力最強、對DPPH·的清除作用最好。以上結果與本文的研究結論有一致性。

圖1 不同提取介質對多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different extraction medium on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols 注:不同小寫字母表示多酚含量差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示自由基清除率 差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 不同濃度溶劑對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖2看出,丙酮濃度對GSP有著較為明顯的影響。在60～100%濃度范圍內,80%丙酮的多酚提取量最高,抗氧化性也最強。推測其原因,這可能是因為80%丙酮溶液的有機組分更好地提取了黃酮醇類、黃烷-3-醇類、芪類多酚等活性成分,水相部分更優地提取了苯甲酸類和肉桂酸類酚酸[10]。正是因為提取物成分的含量及組成不同,造成了羥自由基清除效果的差異。這也解釋了圖2中80%與70%濃度丙酮抗氧化性差異不顯著(P>0.05),但是前者的多酚含量顯著高于后者(P<0.05)的原因。因此，丙酮濃度選擇為80%。

圖2 不同濃度溶劑對多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of solvent on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.3 料液比對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖3可以看出,料液比在1∶10～1∶40 g/mL范圍內,GSP的提取量顯著升高(P<0.05),在1∶50 g/mL時達到最高值,但是1∶40與1∶50 g/mL時的多酚提取量并無顯著性差異(P>0.05),從成本考慮,選用1∶40 g/mL料液比較為合適。從自由基清除率角度來看,其變化趨勢與提取量呈現一致性。推測其原因,一方面是因為總多酚的含量多少對抗氧化性有顯著影響,另一方面是因為溶劑用量的增加能夠促使抗氧化活性強的組分更多地溶出,尤其是在1∶10～1∶40 g/mL用量區間。因此，料液比選擇為1∶40 g/mL。

圖3 料液比對多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.4 提取時間對GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖4看出,相同的提取條件下,隨著時間延長,GSP提取量與羥自由基清除率均呈現先升高后降低的趨勢,在提取90 min時達到最高點。提取時間較短,多酚溶出量有限,故自由基清除活性較低,但是當提取時間過長,多酚雖然提取較為完全,但是由于氧化等原因難免有所損耗,尤其是強抗氧化活性組分。因此，提取時間選擇為90 min。

圖4 提取時間對多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.4 Effect of time on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.2 雙響應面試驗結果

2.2.1 雙響應面試驗結果 在單因素實驗基礎上,應用Box-Behnken進行了三因素三水平的試驗設計。GSP提取量和自由基清除率的雙響應面實驗結果見表2,回歸模型和方差分析結果分別見表3和表4。

表3 基于多酚提取量的方差分析結果Table 3 The variance analysis result based on the extraction amount of polyphenols

注:*P<0. 05,影響顯著;**P<0. 01,影響極顯著;表4同。

表2 雙響應面優化實驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface optimization experiment

使用Design 8.0. 6對雙響應面分析得出y1和y2的回歸方程分別為:

y1(GSP提取量)=72.47+1.19A+4.11B+0.68C-2.98AB-0.29AC+0.69BC-3.46A2-1.41B2-6.38C2

式(1)

y2(GSP自由基清除率)=69.48+0.74A+2.43B+0.37C-2.18AB+0.12AC+0.045BC-2.87A2-1.19B2-4.23C2

式(2)

從表3和表4可以看出,以上兩個模型均顯著(P<0.05),且失擬項不顯著(P>0.05),說明模型擬合性均較好[28]。GSP提取量的回歸方程決定系數為R2=0.9173,說明響應值的變化有91.73%來源于所選三個變量。同理,多酚自由基清除率的回歸方程決定系數為R2=0.8423,說明響應值的變化有84.23%來源于所選三個變量。通過F值可以得出,各因素對多酚提取量和自由基清除率的影響顯著性大小均為:料液比>溶劑濃度>提取時間。變異系數C.V.(%)是衡量每個測量平均值偏離真實情況的參數,其值越小,表明重復性越好,兩個模型的變異系數分別為3.53%和3.51%,均在可接受范圍內,說明該模型的重復性良好[29]。

2.2.2 雙響應面圖結果 響應面圖是響應值在各試驗因素交互作用下得到的結果構成的一個三維空間曲面。由圖5a可以看出,響應曲面的坡度較抖,說明溶劑濃度與料液比的交互作用對GSP提取量影響顯著;溶劑濃度在75～85%范圍內,提取時間在75～105 min范圍內,多酚提取量先增高后降低(圖5b);料液比在1∶35～1∶45 g/mL范圍內,提取時間75～105 min范圍內,隨著料液比的增加,多酚提取量顯著升高(圖5c)。圖5與圖6的變化規律非常類似,與表3和表4的分析結果一致。

表4 基于多酚自由基清除率的方差分析結果Table 4 The variance analysis result based on the radical scavenging rate of polyphenols

圖5 各因素交互作用對多酚提取量影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction amount of polyphenol

圖6 各因素交互作用對多酚自由基清除率影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the polyphenol radical scavenging rate

圖7 基于y1優化的四維交互曲面Fig.7 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y1

圖8 基于y2優化的四維交互曲面Fig.8 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y2

圖9 各因素交互作用對多酚提取量及自由基清除率影響的等高線圖和響應面圖Fig.9 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the extraction amount and radical scavenging rate of polyphenol

2.2.3 雙響應面最佳工藝預測及驗證試驗 通過Design Expert 8.0.6數據分析軟件優化,得到最佳提取工藝參數的理論值為丙酮濃度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取時間91.2 min,此時多酚提取量的理論值為75.48 μg GAE/mg DW,自由基清除率理論值為70.90%。經驗證,多酚提取量實際值為(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率為70.82%±0.11%,與理論值差異不顯著(P>0.05),方法可行。

2.3 Matlab試驗結果及數據分析

通過編程,得到溶劑濃度(%)、料液比(g/mL)、提取時間(min)對GSP含量和羥自由基清除率的四維效果圖(圖7、圖8)。當GSP提取量(y1)取得理論最大值(75.49 μg GAE/mg DW)時,通過矩陣計算得到丙酮濃度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取時間為91.53 min;同理,當GSP羥自由基清除率(y2)取得理論最大值(70.91%)時,丙酮濃度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取時間為90.92 min。

為了更好地描述分析數據間的交互影響,分別繪制當提取時間短(75 min)、中(90 min)、長(105 min)時,料液比與溶劑濃度對y1、y2交互影響的三維旋轉曲面與等高線投影圖(圖9)。

當提取時間(C)取下限值(C=75 min)時,固定料液比(B),隨著溶劑濃度(A)的升高,y1(實線)先增大后減小;固定A值,隨著B的升高,y1持續降低。y2(虛線)趨勢與y1基本一致。此時,y1取值范圍為52.65～67.58 μg GAE/mg DW,y2取值范圍為55.64%～66.29%。當料液比為1∶40～1∶45 mL/g,溶劑濃度在75%～83%時,y1和y2可同時取得最大值。

當提取時間(C)取中間值(C=90 min)時,y1和y2的變化趨勢與C=75 min時一致。此時,y1取值范圍為59.32～75.40 μg GAE/mg DW,y2取值范圍為60.08%～70.90%。當料液比為1∶42～1∶45 mL/g,溶劑濃度約76%～82%時,y1和y2可同時取得最大值。

當提取時間(C)取上限值(C=105 min)時,y1和y2的變化趨勢與C=75 ℃和90 ℃時一致。此時,y1取值范圍為53.22～70.48 μg GAE/mg dw,y2取值范圍為56.05%～67.06%。當料液比接近1∶45 mL/g,溶劑濃度約77%～80%時,y1和y2可同時取得最大值。

綜上所述,當提取時間取中間值(C=90 min)時,y1和y2均能夠取得理論較大值;當丙酮濃度在75%～85%區間,料液比越趨近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趨近最大值;與響應面分析結論一致。

3 結論

本研究采用Box-Behnken雙響應面優化法結合Matlab分析法對GSP進行提取工藝優化及羥自由基清除率測定,得到最優參數為:丙酮濃度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取時間91.2 min,此時,多酚提取量實際值(y1)為(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率(y2)為70.82%±0.11%,均與理論值差異不顯著(P>0.05)。此外,經Matlab分析,當提取時間取中間值(C=90 min)時,丙酮濃度處于76%～82%區間,料液比越趨近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趨近理論最大值;與最終結論一致。雙響應面與Matlab相結合的優化方法,不僅能夠準確得到最佳提取方案,也能夠更直觀的找出合理的工藝參數區間,為葡萄籽工業化加工利用研究提供理論基礎與創新依據。