王漿酸對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

牛佳卉,袁 靜,張慧芳,賈金玉,韓 雪,吳夢穎,張 萌,趙 文

(河北農業大學食品科技學院,河北省農產品加工工程技術中心,河北保定 071001)

王漿酸即10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HAD),是蜂王漿中特有的一種具有獨特生理生物活性的物質,在鮮蜂王漿中含量為1.4%(2.0%左右,其占蜂王漿總脂肪酸比重的55%以上[1]。研究發現[2],王漿酸具有增強免疫力[3-4]、抗菌消炎[5-8]、抗腫瘤[9-10]、抗輻射[11-12]、抗抑郁[13]等功效。

由飲酒造成的急性酒精性肝臟損傷也是現代凸顯的社會主要病癥。長期的酗酒或大量的飲酒會損傷人體的健康,可能會導致人體內器官、系統衰竭,造成一系列的健康問題[14]。根據世界衛生組織的數據表明,2016年全球所有死亡人數中5.3%歸因于酒精,其中歐洲因酒精導致的死亡人數最多可達到10.8%[15]。酒精性肝損傷是由于酒精在機體內,通過引起氧化應激導致氧化產物增加,誘使脂肪在肝臟聚集,發生脂質過氧化反應和炎癥反應,導致肝細胞進一步發生炎癥、壞死、纖維化和硬化[16]。目前酒精性肝損傷已成為僅次于病毒性肝炎的第二大類肝病,且酒精對肝臟的損傷缺乏特異性藥物[17],而現今市售保肝藥物[18],如糖皮質類固醇、多烯磷脂酰膽堿、美他多辛等絕大多數的治療效果不明顯,而且往往具有副作用。因此,開發出安全有效的食品或保健品并通過營養干預預防酒精性肝損傷具有重要意義。

王漿酸具有明顯的生理活性,前期已研究發現王漿酸具有一定的緩解急性酒精中毒的功效,因此本研究通過建立小鼠急性酒精性肝損傷模型,研究王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝功能和血脂水平、肝臟抗氧化水平和機體酒精代謝情況的影響,并觀察其肝臟的組織病理學變化,來評價其護肝作用及初步探究其作用機制,為相關理論研究和王漿酸功能性食品的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

王漿酸(純度≥99.9%) 石家莊維奧生物技術有限公司;水飛薊賓膠囊 天士力制藥集團股份有限公司;雄性ICR小鼠 72只,體重18～22 g,由河北省實驗動物研究中心購入,許可證號:SCXK(冀)2014-12-003;無水乙醇、甲醛和HE染液 天津市科密歐化學試劑有限公司;甘油三酯、總膽固醇(TC)、極低密度脂肪蛋白(VLDL-C)、低密度脂肪蛋白(LDL-C)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)、一氧化氮合酶(TNOS)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、還原型谷胱甘肽(GSH)、單胺氧化酶(MAO)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒 南京建成生物技術有限公司。

Scientz-ⅡD超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;1500-823型全波長掃描酶標儀 Thermo Scientific公司;SPX-250B型生化培養箱 北京鑫骉騰達儀器設備有限公司;3-18R型低溫高速離心機 湖南恒諾儀器有限公司;RM2235型組織病理切片機 德國Leica公司;4590型石蠟包埋機 日本SAKURA精密技術公司;CKX41型倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立及劑量設計 小鼠酒精性肝損傷模型建立:雄性ICR小鼠72只,適應性喂養3 d后,按體重隨機分為陰性對照組、模型對照組、王漿酸低、中、高(33、66、99 mg/kg·bw)劑量組和水飛薊陽性對照組(35 mg/kg·bw),每組12只。陰性對照組和模型組用蒸餾水進行等體積灌胃,連續灌胃30 d。試驗結束時,模型組、陽性對照組及王漿酸各劑量組用50%(v/v)乙醇造肝損傷模型,灌胃量14 mL/kg·bw,陰性對照組用蒸餾水代替,造模后禁食不禁水16 h。

1.2.2 動物處理及樣本采集 末次給藥造模后,將各組動物禁食16 h,然后稱重記錄體重。采用摘眼球取血法,采集小鼠血液樣本,分離血清,-80 ℃冰箱保存備用。然后頸椎脫臼法處死動物,解剖取其肝臟并稱重記錄,取部分肝臟制成10%肝組織勻漿,3000 r/min離心5 min取上清待測。剩余肝臟放置10%的甲醛溶液中固定,進行病理組織形態學檢查。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 肝臟指數 采用1.2.2中造模禁食后小鼠的體重和解剖后肝臟的質量進行肝臟指數的計算。

肝臟指數(mg/g)=肝臟質量/小鼠體重

1.2.3.2 血清生化指標的測定 取血清,嚴格按照試劑盒說明書測定TG、TC、VLDL-C、LDL-C、AST、ALT、ADH和ALDH等生化指標。

1.2.3.3 肝臟生化指標的測定 稱取適量小鼠肝臟組織,按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,制成10%的肝勻漿,然后4000 r/min,離心10 min。取上清液嚴格按照試劑盒說明書測定SOD、MDA、GSH-Px、GSH、MAO、TNOS、iNOS、ADH和ALDH等生化指標。

1.2.3.4 肝臟病理組織學檢查 將固定在10%甲醛中的肝臟,進行石蠟包埋切片、常規的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色[19]后,于光學顯微鏡下觀察肝組織的病理學變化。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠體重及肝臟指數的影響

肝臟指數能夠直觀反映肝臟健康狀況,由表1可知,與陰性對照組比,模型組肝臟指數極顯著降低(P<0.01),說明模型組小鼠造模成功。與模型組比,雖然王漿酸低、中劑量組的肝臟指數無顯著性變化,但各劑量組和陽性對照組的肝臟指數均有所上升,肝臟均受到不同程度的緩解作用,且高劑量組和陽性對照組存在顯著性差異(P<0.05),說明王漿酸具有緩解酒精性肝損傷的作用。此結果與魏芬芬等[20]關于枸杞多糖對小鼠酒精性肝損傷的保護作用及機制研究結果表現一致,表明肝臟指數隨護肝作用的增強而增加。

表2 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠血清脂質的影響Table 2 Effects of royal jelly acid on serum lipids in mice with acute alcoholic liver

表1 王漿酸對酒精急性肝損傷小鼠體重 和肝臟指數的影響Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and liver index of mice with alcoholic acute liver

注:與陰性對照組相比,*:差異顯著,P<0.05,**:差異極顯著,P<0.01;與模型對照組相比,#:差異顯著,P<0.05,##:差異極顯著,P<0.01;表2～表7同。

2.2 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠生化指標的影響

由表2可知,與陰性對照組比,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、VLDL-C的含量均極顯著上升(P<0.01),表明攝入過量的酒精能夠引起脂代謝紊亂。與模型組比,除低劑量組VLDL-C的含量顯著性降低(P<0.05),其余各劑量組和陽性對照組血清脂質指標含量均極顯著降低(P<0.01),高劑量組的降脂效果同陽性對照組相近。TG、TC、VLDL-C、和LDL-C常作為肝功能的輔助參考指標[21]。當肝臟出現纖維化或者肝硬化時,其血脂指標一般表現為TG、TC、VLDL-C、LDL升高,HDL降低[22]。本實驗結果同啜文婷等[23]研究結果相同,說明王漿酸具有調節小鼠血脂代謝,緩解脂質代謝紊亂的作用。

表3可知,與陰性對照組比,模型組小鼠血清中AST和ALT活性極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對照組的AST和ALT活性極顯著降低(P<0.01),其活性隨王漿酸劑量的升高而降低,且高劑量組的護肝效果最佳與陽性對照組效果相近。AST和ALT是廣泛應用于檢測肝損傷的指標[24]。羅安玲[25-26]等報道,大量飲酒后,肝臟受到酒精及其代謝產物的毒性影響,細胞膜通透性改變,導致肝細胞胞漿內AST和ALT進入到血液中,造成血清中活性升高。這與本實驗模型組血清中AST和ALT活性顯著性升高的結果一致。本研究發現王漿酸能夠降低AST、ALT的活性,這與張建軍[27]等的研究結果相同,說明王漿酸具有降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中AST和ALT活性的作用。分析其降低酶活性的原因可能是因為王漿酸具有保護細胞膜的功能,能夠調節細胞膜的通透性,使其通透性恢復到正常狀態,維持細胞器基本結構的生態穩定,從而減少了肝臟細胞中AST和ALT這兩種酶流入血液,表現為血清中兩種酶的活性隨著王漿酸劑量的升高而降低。

表3 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT 和AST活性的影響Table 3 Effects of royaljelly acid on serum ALT and AST activity in mice with acute alcoholic liver

2.3 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠機體酒精代謝的影響

由表4知,與陰性對照組比,模型組小鼠肝組織中ADH活性都顯著升高(P<0.05)，ALDH活性極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對照組的ADH活性都極顯著升高(P<0.01);對于ALDH活性,王漿酸低劑量組無顯著性變化,而中、高劑量組和陽性對照組都極顯著升高(P<0.01)。

表4 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟ADH 和ALDH活性的影響Table 4 Effect of royal jelly acid on the activity of ADH and ALDH in liver of mice with

表5 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠血清ADH 和ALDH活性的影響Table 5 Effect of royal jelly acid on serum ADH and ALDH activity in mice with acute alcoholic liver

由表5可知,與陰性對照組比,模型組小鼠血清中ADH和ALDH酶活力均極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸低、中劑量組血清中ADH和ALDH酶活無顯著性變化,但高劑量組ADH酶活顯著升高(P<0.05),ALDH的酶活極顯著升高(P<0.01);陽性對照組ADH和ALDH的酶活均極顯著升高(P<0.01)。綜合分析,王漿酸對于解酒作用的功效,高劑量組效果最佳。

乙醇脫氫酶氧化體系是肝臟分解代謝外來酒精的主要方式,其中起到關鍵作用的是ADH和ALDH[28]。ADH作為一種短鏈醇代謝酶,能將機體攝入的乙醇進行第一階段的催化分解生成乙醛。而ALDH的主要作用是把乙醛催化為乙酸,再經過TCA循環最終生成CO2和H2O,消除酒精對肝臟的損傷[29]。

表6 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 6 Effect of royal jelly acid on antioxidant capacity of liver in mice with acute alcoholic liver

表7 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MAO、TNOS、iNOS活性的影響Table 7 Effect of royal jelly acid on the activity of MAO,TNOS and iNOS in liver of mice with acute alcoholic liver

本實驗從血清和肝臟組織兩個角度對ADH和ALDH進行檢測分析,結果發現小鼠一次性大量攝入酒精后,機體產生自然應激反應代謝分解酒精以緩解對肝臟的損傷,模型組和劑量組肝臟內的ADH和ALDH活力會明顯升高,并與劑量成正相關。本結果與白美美[30]對連翹葉茶保肝作用研究中表現出來的結論一致,分析原因可能是由于王漿酸具有輔助性刺激肝細胞進行乙醇代謝的催化作用。

2.4 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織抗氧化能力的影響

由表6可知,與陰性對照組比,模型組的SOD、GSH-Px活力和GSH的含量極顯著降低(P<0.01),而MDA含量極顯著增加(P<0.01),說明模型組的肝臟抗氧化能力減弱。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對照組的GSH-Px、SOD活力和GSH含量極顯著增加(P<0.01),而MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

SOD和GSH-Px是機體主要的抗氧化酶,MDA是脂質過氧化的產物,能反映機體的脂質過氧化程度,間接反映細胞損傷的程度[31-32]。當攝入過量的酒精時,會造成肝細胞發生脂質過氧化,生成過量的氧自由基造成氧化應激,最終促進脂質氧化過程[33]。從結果可看出王漿酸能夠增加GSH-Px、SOD活力和GSH含量,減少MDA的含量,因此王漿酸有一定的抗氧化能力,能夠緩解肝細胞脂質過氧化進程,起到對肝臟的保護作用。

由表7可知,與陰性對照組比,模型組小鼠MAO活力極顯著升高(P<0.01),TNOS和iNOS活力極顯著降低(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對照組的MAO活力極顯著降低(P<0.01),而除低劑量組的TNOS活力無顯著性變化,其余各組TNOS和iNOS活力極顯著增加(P<0.01)。說明王漿酸具有良好的護肝效果,且與劑量成正相關。

有研究表明,MAO參與膠原代謝,使膠原和彈性硬蛋白結合,形成膠原纖維導致肝臟纖維化,是評價肝臟損傷的重要指標[34-35]。NO具有舒張血管、抑制血管平滑肌的增殖和中性粒細胞浸潤等功能,但其又能生成具有毒性的過氧化亞硝酸鹽,導致組織損傷[36-37]。常用NOS指標來反映NO,而NOS在機體內分為nNOS、eNOS和iNOS,當組織受到損傷時iNOS會產生應激效果,使其活力升高,iNOS活性升高會引起NO的合成增加[38]。從結果可看出王漿酸能夠降低MAO的活性,提高TNOS和iNOS的活性來達到護肝的效果。其護肝途徑可能是通過iNOS活力的升高,帶動NO含量的提高,NO可以舒張血管,加快血液循環,加速酒精代謝產物CO2和H2O的排除,輔助起到護肝的效果。

2.5 王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織形態的影響

由圖1可知,陰性對照組小鼠肝臟結構清晰,肝小葉排列整齊,肝細胞以中央靜脈為軸心呈大致輻射狀排列。模型組的肝細胞索紊亂,肝細胞腫脹呈氣球樣變,胞質疏松,胞質內能夠觀察到脂肪空泡和水樣變性且大小不等、數量不一,多個壞死在小葉內發生呈現點狀或灶型,炎細胞侵入到匯管區中數目眾多。王漿酸低劑量組肝臟組織情況與模型組情況近似。王漿酸中、高劑量組肝組織情況均有明顯緩解,肝細胞胞質較為緊密,脂肪空泡和水樣變性數量明顯減少,小葉內壞死程度明顯降低,匯管區有少量炎細胞侵潤。陽性對照組肝組織有明顯的治愈效果,肝臟組織結構清晰,肝小葉排列基本整齊,肝細胞呈正常多邊形,胞質內脂肪空泡和水樣性變數量較少。

圖1 王漿酸對急性酒精性肝損傷 小鼠肝臟組織的病理學影響(HE,400×)Fig.1 Pathological effect of royal jelly acid on liver tissue in mice with acute alcoholic liver injury(HE,400×)

3 結論

王漿酸對急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟具有保護作用,王漿酸能夠升高肝臟指數,同時降低血清中TC、TG、VLDL-C和LDL的含量,降低血清中AST、ALT活性來達到其護肝作用,并且王漿酸中、高劑量組能夠有效減少肝臟組織中脂肪空泡和水樣變性情況的發生,維持肝細胞正常生態生理結構的穩定。通過王漿酸能夠促進ADH、ALDH的分泌,提高SOD、GSH-Px、TNOS、iNOS活性和GSH的含量,降低MDA的含量和MAO的活性,初步探究其護肝機制可能是通過對肝臟細胞因子進行輔助調節,加速酒精代謝分析,減少脂質過度積累,從而降低一次性大量酒精攝入對肝臟造成的損傷程度,并且若長期服用王漿酸還可有效地增強肝臟抗氧化能力。但王漿酸的作用時間和護肝效果是否存在相關性,還有王漿酸的調節細胞因子的具體通路,還需要進一步試驗驗證。以上結果說明王漿酸具有護肝功能,為其功能性食品的進一步開發利用,提供了一定的理論依據。