液體活檢在早期HCC診斷中的應用

鄭立威 袁荻森 劉佳 魯鳳民

在我國的常見惡性腫瘤中，原發性肝癌居第4位，腫瘤致死病因的第2位，嚴重危害國人健康[1]。肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌的主要病理類型，在我國，約86%的HCC與乙型肝炎病毒(HBV)感染相關[2]。對于早期肝癌患者，通過肝切除術在內的根治性治療可顯著改善預后。然而，HCC發病隱匿，患者被診斷時多已在晚期，預后差。

肝臟超聲檢查(US)聯合血清甲胎蛋白(AFP)是目前對HCC高危人群進行肝癌篩查的主要措施。隨著影像學技術的進步，螺旋CT、PET-CT等檢查及異常凝血酶原(DCP)、血清甲胎蛋白異質體(AFP-L3)等新的血液分子標志物的應用，肝癌診斷的敏感性和特異性有所提高，但臨床上對早期HCC的診斷能力仍十分有限，因此亟待尋找一種檢測早期HCC的新型診斷手段。

液體活檢是近年來研究較多、技術逐漸完善的一種新型診斷方法，通過對體液(血液、尿液、淚液)中包含疾病信息的成分，如細胞外囊泡、循環核酸等進行分析，以獲取患者疾病狀態相關信息。液體活檢樣本獲取方便，檢測靈敏度高、特異性好，有較大發展潛力。

一、細胞游離DNA

細胞游離DNA(cfDNA)是一類長度120～160 bp的DNA片段，主要來源于凋亡或壞死細胞。腫瘤患者血液中的cfDNA主要來源于壞死的腫瘤細胞，這部分DNA與其來源的腫瘤細胞具有相同的突變類型。對HCC患者血清中的cfDNA進行深度測序能夠檢測到在HCC中高頻突變的癌基因及抑癌基因。

(一)cfDNA突變 Cohen 等[3]建立的“CancerSEEK”方法利用61-擴增子板多重聚合酶鏈式反應擴增樣本，進而對包括肝癌在內的8種腫瘤中的16個高頻突變基因進行分析，并通過單分子免疫檢測平臺檢測8種蛋白標志物(每種標志物在至少一種腫瘤中高表達)，能有效、可靠地從健康對照中鑒別腫瘤患者。結果顯示，在44例肝癌患者中(89%為HCC)，CancerSEEK特異度為60%，靈敏度為97%，對其中5例早期肝癌患者(I期)的診斷靈敏度為100%。

全球超過50%的原發性肝癌與HBV感染有關。Qu等[4]通過聯合循環cfDNA上的體細胞突變、HBV整合、cfDNA濃度及血液中的蛋白標志物(AFP和DCP)與年齡、性別等多種因素，開發出了一種能夠診斷早期HCC的液體活檢方法 “HCCscreen”。 他們首次對HCC高危人群進行分析，將HBsAg(+)、血液AFP> 20 ng/mL或/和US檢測到肝臟存在可疑結節,但增強MRI/CT未診斷HCC的患者定義為高危人群。在這類高危人群組成的訓練集中，HCCscreen具有良好的診斷效能(AUROC=0.93；靈敏度85%，特異度93%)。在331例AFP正常、US無可疑結節的HBsAg(+)患者中，成功鑒定出了4例HCC患者，這些患者均處于疾病早期(結節<3 cm)，診斷靈敏度為100%(4/4)，特異度為94%(307/327)，陽性預測值為17%。但 “HCCscreen”是否適用于HBsAg陽性者之外的其他人群，有待驗證。

(二)cfDNA表觀遺傳學改變 近年來發現，cfDNA特定基因的異常甲基化及羥甲基化修飾可作為HCC的診斷標志物。由于甲基化修飾帶來的基因沉默效應，HCC患者cfDNA異常甲基化主要出現在HCC相關的抑癌基因上。考慮到腫瘤患者cfDNA上同樣可檢測到與原發腫瘤細胞相一致的甲基化及羥甲基化修飾改變，Xu等[5]開發的10個基因甲基化標志物組合能從健康對照、HBV/HCV感染患者、脂肪肝患者中鑒別HCC患者，其靈敏度與US相當；該團隊開發的由8個基因甲基化標志物組成的聯合預后評分系統還能用于HCC患者預后預測，從而調整患者治療方案。

有報道發現，包括肝癌在內的不同腫瘤細胞來源的甲基化cfDNA在患者出現臨床癥狀前即可存在于患者血液[6]。近期Chen等[6]開發了一項基于cfDNA甲基化的多癌篩查技術“PanSeer”，該技術通過半靶向PCR技術構建cfDNA測序文庫，解決了傳統重亞硫酸鹽轉化技術進行甲基化測序時DNA損失率較高、靈敏度低等問題，能夠高效、靈敏地檢測微量cfDNA上477個基因組區域中10 613個CpG位點的甲基化情況。在98例未確診腫瘤之前1～4年采集的患者血液樣本中，該診斷方法的檢測靈敏度達95%。

除甲基化外，近年來研究人員也注意到cfDNA羥甲基化修飾在HCC診斷中的潛在作用。DNA羥甲基化是甲基化DNA的5-甲基胞嘧啶被催化形成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)的過程，5-hmC可作為一種穩定的表觀遺傳學標記，在基因的轉錄調控、染色體重編程中發揮重要作用，與腫瘤的發生密切相關。Cai等[7]從血漿cfDNA中篩選了由32個基因組成的5-hmC標志物組合，基于此開發的加權診斷模型被證明可用于HCC患者與健康人及其他腫瘤患者的鑒別。

二、循環非編碼RNA

非編碼RNA(ncRNA)由長度>200 bp的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和長度在18～22 nt的微小RNA(miRNA)構成，細胞的惡性轉化伴隨lncRNA、miRNA的表達異常。其中存在于體液中的循環miRNA是研究最廣泛的一種短鏈ncRNA。Zhou等[8]檢測了934例參與者，其中包括健康受試者、慢性乙型肝炎(CHB)患者、肝硬化(LC)患者和HBV相關HCC患者，包含miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a和miR-801在內的一組miRNA能夠準確區分不同BCLC分期的HCC患者，靈敏度和特異度分別達到了82%和84%。該組miRNA同樣準確區分了HCC患者與健康受試者、CHB和肝硬化患者。

Tan等[9]對來自血漿和外泌體的RNA進行了測序、分析，發現除miRNA外，多種血漿ncRNA亦可作為HCC診斷和預后的生物標志物。這類血漿ncRNA可能因為特殊的二級結構或與RNA結合蛋白結合而未被RNA酶降解，具有生物學活性，如其中的RN7SL1 S片段可促進腫瘤細胞增殖，并發現這些循環ncRNA能夠靈敏、特異地區分HCC、CHB和健康受試者。

三、細胞外囊泡

細胞外囊泡(EVs)可由細胞主動釋放至細胞外環境，包含多種具有生物活性的脂質、蛋白質、mRNA、miRNA、lncRNA、DNA成分，能夠介導細胞間通訊。其中，外泌體是研究最廣的一類EVs，其直徑約為30～150 nm，可存在于血液、唾液、尿液和母乳中。

包括腫瘤細胞在內的所有細胞都能釋放外泌體，但其成分在疾病和生理狀態下存在顯著差異。研究表明，外泌體中部分miRNA與蛋白質參與了HCC的發生、遷移、侵襲，并且在HCC中有特異性的表達。由于外泌體的膜性結構能夠保護內含的miRNA、lncRNA免受RNA酶降解，其在體液中的穩定存在使外泌體核酸成分較單純的循環核酸更具有優勢。Cho等[10]發現腫瘤細胞來源的外泌體miR-10b-5p可作為HCC的早期診斷生物標志物(AUROC= 0.934；靈敏度90.7%，特異度75.0%)。除miRNA外，研究較多的外泌體環狀RNA(circRNA)也可作為診斷標志物。例如，Wei等[11]報道了circRNA_101237的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期有關，具有作為HCC診斷標志物的潛力。

四、循環腫瘤細胞

循環腫瘤細胞(CTCs)是指自發或者因診療操作自腫瘤原發灶或者轉移性病灶脫落進入外周血液循環系統的腫瘤細胞。對CTCs進行測序能夠反映參與HCC上皮-間質轉化、遷移及治療后的復發等進程的相關差異基因，并且能夠較好地反映腫瘤在患者體內的動態變化，在HCC的早期診斷中具有一定意義[12]。隨著檢測技術的不斷進步，CTCs的檢測也越來越方便，在HCC 其他腫瘤的早期個性化診斷中有十分廣闊的應用前景。需要注意的是，不同腫瘤患者之間、同一患者不同腫瘤部位，甚至同一腫瘤不同腫瘤細胞之間均存在明顯的異質性。

五、挑戰與展望

近年來的多項研究已經證實了液體活檢在HCC診斷中極具潛力的應用價值。相較于AFP、DCP等傳統的HCC無創篩查指標，基于血漿cfDNA、RNA及細胞外囊泡等成分的液體活檢方法具有靈敏度高、特異性好等優勢，能夠在HCC疾病早期予以檢出。但是，需要注意的是，盡管循環血中的cfDNA上的遺傳學或表觀遺傳學改變能夠較靈敏、特異地診斷HCC，但研究人員仍需警惕診斷過程中假陽性事件的發生。一個可能的原因是由于慢性肝炎(如HBV、HCV)或肝硬化患者的cfDNA中也可能存在HCC相關突變或病毒基因整合事件，即部分驅動突變在HCC發生前已存在；而在健康人群中，循環cfDNA中的JAK2、TP53、KRAS突變可來源于造血細胞[13]，從而增加了假陽性事件的發生。臨床醫生在利用cfDNA突變進行腫瘤診斷時，或需同時對配對的外周血細胞進行基因分型以排除來源于造血細胞的突變，或者結合HCC特異性突變(CTNNB1、AXIN1等)輔助診斷，避免誤診。

慢性乙型肝炎、肝硬化患者是HCC的高危人群，對這類患者的篩查進行定期HCC篩查監測，有助于HCC的早期發現、早期診斷及早期治療，具有較高的效益成本比，同時也是提高肝癌療效的關鍵[1]。如HCCscreen用于HBsAg(+)的無癥狀社區人群的HCC篩查可檢出AFP和CT難以診斷的早期HCC患者。最近的一項國際多中心的研究顯示[14]，基于患者年齡、性別及實驗室檢測指標白蛋白、膽紅素測定和血小板計數的風險預測模型“aMAP”，可以將不同病因的慢性肝病患者進一步劃分為肝癌低危和高危人群。這種對高危人群的精細界定可能有助于進一步提高液體活檢陽性預測值過低的問題。

目前，液體活檢從樣本采集、處理、質量控制到數據分析的各個過程仍有待進一步簡化、規范化與標準化，如外泌體、cfDNA等提純方法需要統一。此外，如何在不影響CTCs特性的情況下予以分離同樣是亟待解決的問題。

近年來隨著對這類診斷方法研究的不斷深入，其診斷成本也在逐漸下降。希望在不久的將來，液體活檢技術能夠成功運用到臨床HCC的早期診斷中，使患者得到及時治療，從而改善預后。