不同溫度下淹水對辣椒疫病的防效研究

侯宗海 王光飛 馬艷 梁永紅 仇美華

摘要：以辣椒疫病發生嚴重的大棚土壤為研究對象，研究不同溫度下淹水對不同辣椒疫霉數量病土辣椒疫病的防控效果，并對土壤常規微生物數量、辣椒疫霉數量進行動態分析，此外，也分析了與防病反應相關的植物生理指標。結果顯示，土壤淹水會明顯減少土壤中真菌、放線菌和辣椒疫霉的數量，而對細菌有增殖作用，這種現象在環境溫度為35℃/30℃時更為明顯。溫度設置為30℃/25℃時，自然病土保濕處理病情指數在55%以上，淹水20、35d對自然病土防效均為100%。自然病土接種辣椒疫霉孢子1000個/g后保濕處理病情指數在80%以上，淹水25、35d防效分別為38.3%、28.3%。35℃/30℃下自然病土保濕和淹水處理均無發病，接菌病土保濕處理病情指數為8.3%～11.7%，而淹水處理無發病。與防病反應相關的植物生理指標與病情指數呈顯著或極顯著正相關，這些進一步證實了溫度偏高時淹水防控效果更佳，而淹水天數設為20d即可。

關鍵詞：土壤;淹水溫度;辣椒疫霉;防控效果

中圖分類號：S436.418.1+9文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0111-05

作者簡介：侯宗海（1977—），男，江蘇豐縣人，高級農藝師，主要從事土壤肥料研究。E-mail：xftfz@163.com。

通信作者：馬艷，博士，研究員，主要從事植物營養與廢棄物資源化利用研究。E-mail：myjaas@sina.com。

將病土進行淹水處理以抑制土傳病害發生是一種常見的防病農藝措施[1-3]。有多位學者對淹水防控土傳病害進行了研究，Pullman等的研究顯示，夏天長時間淹水可有效抑制棉花黃萎病，這與其顯著削減土壤中大麗輪枝菌病原菌相關[4]。絲核菌、鐮刀菌、青枯假單胞菌等土壤病原菌也能被淹水措施控制[5-7]。Stolzy等研究表明，淹水措施能有效防治病原真菌引起的病害，但不能防治疫霉等低等卵菌土傳病害[1]。也有研究表明，短期淹水反而能加快、加重疫霉引起的病害[8-9]。但在江蘇省淮安市辣椒生產基地，有些農戶將大棚土壤進行淹水以防控辣椒疫霉（PhytophthoracapsiciL.）引起的病害，并取得了一定的效果，但防控效果不穩定。可見，土壤淹水對辣椒疫病是有防效的。

土壤中辣椒疫霉的生存和致病性與土壤溫度密切相關[10-11]，因此推測不同溫度下的土壤淹水處理對辣椒疫病的防效具有差異性。鑒于實際生產中淹水措施主要在夏季進行，所以本試驗以不同濃度辣椒疫霉土壤為試驗對象，人為模擬2種夏季田間溫度環境，以研究不同溫度下土壤淹水對辣椒疫病的防控效果。此外，我們在不同淹水溫度的基礎上設置淹水時間變量，以進一步判定淹水對辣椒疫病是否具有防控作用，并明確何種淹水條件下防控效果最佳。另外，通過對土壤常規微生物和辣椒疫霉進行動態定量分析，以明確淹水措施是否能改變土壤微生物，是否能減少土壤辣椒疫霉的數量，以及兩者的聯系。病情指數是不同條件下的淹水是否具有防控效果的最佳指標，但具有隨機性和誤差性。因此通過測定植株與防病反應相關信號物質的含量，可以更精確判定不同淹水條件對辣椒疫病的防控效果。

1材料與方法

1.1試驗材料

在淮安市鹽河鎮辣椒大棚取試驗土壤，大棚辣椒種植年限為8年，辣椒疫病嚴重。土壤基本性狀為：有機質含量31.53g/kg、全氮含量4.55g/kg、全磷含量1.45g/kg、全鉀含量11.74g/kg，pH值7.42。供試辣椒疫霉病菌為該棚辣椒病株分離所得。供試辣椒品種為洛椒5號。

1.2試驗方法

將土壤與草炭以體積比5∶1混合，并加入10g/kg的有機肥。土壤設置不同的辣椒疫霉接種濃度、水分管理和溫度處理：辣椒疫霉接種濃度分別為0、1000個/g;水分管理分別為保濕20d（對照1）、淹水20d、保濕35d（對照2）及淹水35d;溫度處理分別為30℃/25℃和35℃/30℃。30℃/25℃即30℃、12h，25℃、12h，間隔交替。35℃/30℃即35℃、12h，30℃、12h，間隔交替。共計16個處理。環境溫度通過氣候箱設置。2012年3—4月在氣候箱的塑料箱（長、寬、高分別為0.4、0.2、0.2m）中進行淹水或保濕處理，淹水結束后將土壤攤開，置于陰暗通風處快速晾干后分裝到5個塑料盆中（長、寬、高分別為0.25、0.12、0.12m），每盆移栽3棵辣椒苗。總計15棵辣椒苗，每5棵為1個重復。盆栽地點為江蘇省農業科學院溫室。

分別在淹水前、淹水后4、9、18、27、35d和移栽后10、20d取土，以接種辣椒疫霉孢子1000個/g（干土）的保濕35d組和淹水35d組為分析對象，分析土壤中常規微生物和辣椒疫霉的數量動態變化。在辣椒發病前，各處理均取頂端第4、5張葉測定與植株防病反應相關的信號物質。移栽20d后統計辣椒病情指數。

1.3測定項目及方法

1.3.1土壤常規微生物數量真菌、細菌和放線菌數量測定采用試管梯度稀釋涂平板法[12]。

1.3.2土壤中辣椒疫霉數量采用MP公司的FastDNA試劑盒提取土壤DNA。采用qPCR技術測定辣椒疫霉菌數量，特異引物為CAPFW（5′-TTTAGTTGGGGGTCTTGTACC-3′）和CAPRV1（5′-CCTCCACAACCAGCAACA-3′）[13]。[JP3]qPCR試劑盒為TaKaRa公司的SYBRpremixExTaq[12]。將標準土樣DNA（接種10、40、160、640、2560、10240個/g辣椒疫霉孢子的6個土樣提取的DNA）與待測土樣DNA同時上機擴增，根據標準曲線計算出待測樣品疫霉數量。

1.3.3與辣椒植株防病反應相關信號物質的測定測定辣椒葉片內幾丁質酶活性、超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量[14]。幾丁質酶活性采用顯色法，以1g葉片1h分解膠體幾丁質產生N-乙酰氨基葡萄糖的微克數表示。O-2·測定采用羥胺氧化反應法。H2O2含量測定采用Ti（Ⅳ）-H2O2比色法。

2結果與分析

2.1土壤及辣椒根際常規微生物數量動態變化

從圖1可以看出，不同溫度淹水處理下，土壤的真菌、細菌和放線菌數量的變化趨勢各不相同。

土壤處理前8d，在2種溫度下真菌變化趨勢一致，即淹水組真菌數量明顯下降，而對照真菌數量明顯增加。隨后，30℃/25℃對照組真菌數量繼續上升，最后維持在88×103CFU/g左右，而35℃/30℃對照組開始逐漸下降，處理結束時真菌數量為47×103CFU/g。30℃/25℃淹水組和35℃/30℃淹水組在淹水處理8～35d真菌數量基本維持在19×103CFU/g左右。栽植辣椒后，30℃/25℃對照組真菌數量下降，降幅較小，其余組真菌數量明顯增加，栽植20d各組真菌數量相當。

30℃/25℃對照組、35℃/30℃對照組和30℃/25℃淹水組的放線菌數量在8d內都有較大的上升，而35℃/30℃淹水組數量有所下降。隨后，對照組數量繼續上升，而30℃/25℃淹水組數量開始下降。處理結束時，30℃/25℃淹水組與35℃/30℃淹水組放線菌數量的比值是1.45。辣椒栽植后，對照組放線菌數量有一定的增加，而淹水組放線菌數量則猛增至對照組水平。

處理期2種溫度下，對照組的細菌數量變化一致，在前17d內下降較快，隨后維持不變。淹水組的細菌數量變化較為復雜，但都有一個高峰和低峰，低峰值與同期相應對照組的數值相差較小，高峰值是同期對照組值的2倍及以上。辣椒栽植后，對照組細菌數量變化較小，淹水組細菌數量呈現上升趨勢。

2.2土壤及根際辣椒疫霉數量動態變化

[JP3]6個標準樣DNA進行擴增后，用ABI7500繪制標準曲線，如圖2所示，R2=0.991，擴增效率為91.4%，在規定的90%～110%范圍內。熔解曲線為單峰，符合RT-PCR要求。因此，定量檢測結果可靠。

接種1000個/g辣椒疫霉孢子的病土在土壤處理期和辣椒栽植期的土壤辣椒疫霉數量變化趨勢見圖3。土壤接入辣椒疫霉后，大部分辣椒疫霉在處理期前9d內死亡。分別比較30℃/25℃對照組、35℃/30℃對照組和30℃/25℃淹水組、35℃/30℃淹水組，可知，2種處理的辣椒疫霉在35℃/30℃下的生存率都小于30℃/25℃。處理結束時，30℃/25℃對照組與35℃/30℃對照組的土壤辣椒疫霉數量比值是2.73，30℃/25℃淹水組和35℃/30℃淹水組比值是1.65。另外，比較同一溫度處理下的對照組和淹水組，可知，淹水能加重土壤辣椒疫霉數量的削減。處理結束時，30℃/25℃下，對照組土壤中疫霉的濃度是淹水組的4.89倍，而35℃/30℃下，對照組土壤中疫霉的濃度是淹水組的2.95倍。栽植辣椒后，對照組和淹水組辣椒疫霉數量都有一定的增加。

2.3辣椒葉片中與植株防病反應相關的信號物質

由表1可知，30℃/25℃下，無論是對照組還是淹水組，接種1000個/g辣椒疫霉孢子的病土組與不接種辣椒疫霉孢子的病土組相比較，前者的3種植物信號普遍大于后者，這說明3種植物信號能確切反應植物與防病相關生理指標的變化，尤其是超氧陰離子產生速率和幾丁質酶活性。淹水20d組和淹水[KG*8]35d[KG*8]組植物中的幾丁質酶活性和超氧陰離子產生速率顯著低于對照1組和對照2組，另外，淹水20d組與淹水35d組相比，3種植物信號基本一致，所以可以看出淹水20d與淹水35d對疫病有防控效果，且兩者效果相當。

35℃/30℃各組的植物信號值普遍小于30℃/25℃組的對照1組和對照2組，而和30℃/25℃組的淹水20d組和淹水35d組的植物信號值相當，這與35℃/30℃組各處理都不發病或發病低相關。35℃/30℃組的對照組植物信號值略大于對應淹水組，這應該與土壤處理后對照組疫霉數量低于淹水組相關。

2.4辣椒疫病病情指數

由表2可知，環境溫度設置為35℃/30℃時，接種辣椒疫霉孢子濃度為1000個/g的對照組病情指數為8.3%～11.7%，而其余處理辣椒的病情指數都為0。環境溫度設置為30℃/25℃時，各處理病情指數差異顯著。自然病土保濕處理不同時間后栽植辣椒，辣椒的病情指數為56.7%～58.3%。淹水20d或35d后栽植，辣椒病情指數都為0。由此可見，在本試驗條件下自然病土淹水20d就能達到對辣椒疫病100%的防效。接種辣椒疫霉孢子濃度為1000個/g的病土保濕處理不同時間后，病情指數為81.7%～83.3%。淹水20、35d再栽植辣椒，對應的病情指數分別為38.3%、28.3%，防效分別為53.1%、66.0%。因此可以看出，對于重病土淹水對辣椒疫病也有良好防控效果，且淹水35d的防效比20d略高，但兩者無顯著差異。

3討論與結論

本試驗常規微生物的數量變化說明了淹水對土壤真菌、放線菌和細菌產生很大的影響。淹水能明顯減少土壤真菌和放線菌數量。淹水對細菌的影響較為復雜，在一定的淹水時段能明顯增加土壤細菌數量。由此可見，淹水能明顯改變土壤微生物區系。Unger等的研究表明，20℃下24d的淹水處理對森林土壤微生物區系有較大的影響[15];Wilson等的研究顯示，17～20℃下56d的淹水處理后，溫室土壤微生物群落結構有顯著的變化[16]，本文的試驗結果與之相符。晾土后栽植辣椒，土壤中不利微生物生長因素消除，所以土壤真菌、放線菌數量上升至對照組水平。淹水土壤中的辣椒疫霉數量、真菌數量、放線菌數量的變化規律在一定程度上相似，即在淹水期逐漸減少，栽植辣椒后有所上升。35℃/30℃下保濕處理中后期，真菌數量開始逐漸減少，這說明35℃/30℃下不利于真菌的生存，所以可以推測35℃/30℃會降低辣椒疫霉的生存率。

通過比較分析不同溫度下對照組和淹水組土壤辣椒疫霉的存活率，可以明確不同溫度的淹水對土壤辣椒疫霉存活率產生的影響。在本試驗土中，淹水處理可一定程度削減土壤辣椒疫霉數量，且35℃/30℃下效果更好，這與淹水后土壤生物性狀和理化性狀的變化相關。前人研究報道，淹水對土傳病害有防效，可能與土壤微生物區系的變化及抗病微生物的增加有關[1，17]，抗病微生物是否增加還有待于進一步研究。淹水期間短期激發增殖的某些細菌種類可能對辣椒疫霉抑制具有貢獻。本研究證實了土壤微生物發生了明顯的變化，這必然對土壤辣椒疫霉的存活率和致病性產生不可忽視的影響。土壤淹水后氧化還原電位降低，氧氣含量減少，對病原菌有害物質增加等也是土壤病原菌數量減少的重要原因[18]。溫度較高時微生物呼吸需要更多的氧氣，35℃/30℃下[JP3]淹水較30℃/25℃下淹水除氧速率快且含氧量低，所以病原菌在35℃/30℃下更能被淹水處理抑制[1]。在本試驗中35℃/30℃對照組比30℃/25℃對照組辣椒疫霉存活率低，這說明了30～35℃環境下不利于辣椒疫霉的生存。所以35℃/30℃下淹水土壤辣椒疫霉存活率低，溫度對其產生的影響也是原因之一，這與35℃/30℃下的真菌數量明顯少于30℃/25℃下相吻合。

植物受到病原真菌、細菌、線蟲等浸染后均可產生并積累H2O2和超氧陰離子。兩者在植物抗病反應中起著重要的作用[19-21]。幾丁質酶是可誘導的病程相關蛋白，可抵抗病原菌的侵染[22]。統計分析各組的病情指數和3種植物信號，結果顯示兩者是密切相關的。超氧陰離子產生速率、幾丁質酶活性與辣椒病情指數呈極顯著正相關，相關系數分別為0.929、0.898（P<0.01），過氧化氫含量與辣椒病情指數的呈顯著正相關，相關系數為0.554（P<0.05）。30℃/25℃下各淹水組3種植物信號明顯小于對應30℃/25℃對照組，這說明土壤淹水后辣椒植株受到的辣椒疫霉侵染少，H2O2和超氧陰離子產生和積累較非淹水組少，幾丁質酶也不被誘導，這與Esra等的研究報道[23-24]相符。所以，可以從植物信號中看出淹水措施對辣椒疫病有防控作用。35℃/30℃各組植物信號數據與病情指數相符合，數據普遍較低，且差異不顯著。這在一定程度上說明了35℃/30℃下不利于辣椒疫霉的生存和其對辣椒的侵染。

環境溫度設置為25～30℃時，對于自然連作土而言，淹水20、35d都能達到100%防效。對于接種1000個/g辣椒疫霉孢子的重病土而言，淹水35d的防效僅比淹水20d高10%。在實際生產中，保護地并沒有35d及以上的空閑時間，所以采用淹水措施時可以適當縮短至20d左右。在本試驗條件下，30～35℃下淹水20d即可100%防控自然病土和重病土辣椒疫病。鑒于本試驗為室內模擬試驗，所以不能保證在田間實施后會有一樣的效果，但可以確定利用淹水防治辣椒疫病時，應優選氣溫最高的月份。25～30℃下接種辣椒疫霉孢子1000個/g的土壤淹水處理后的病情指數為28.3%～38.3%，可見利用淹水措施防控辣椒疫病具有一定的不穩定性。另外，即使是35℃/30℃淹水組，在淹水后土壤中仍存在一定數量的辣椒疫霉。之所以不致病，可能是辣椒疫霉數量沒有達到致病濃度，或者辣椒疫霉致病力被削弱。所以，考慮到田間土壤狀況更為復雜，在田間利用淹水措施防控辣椒疫病時，有必要結合其他有效防控措施。

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