一株乳酸菌的分離鑒定及在蘋果汁發酵中的應用

潘勇 李建宋 趙思潔 廖祥儒 郝之奎

摘要：從蘋果樹根際土壤中篩選獲得一株產酸菌株，經形態學和生理生化特征結合分子生物學研究，鑒定為植物乳桿菌，命名為LactobacillusplantrumasZ;以蘋果為原料，將乳酸菌LactobacillusplantrumasZ應用于蘋果汁發酵，通過單因素和正交試驗，初步確定發酵蘋果汁的最佳工藝條件為在蘋果汁含量為35%、接種量為5%、蜂蜜添加量為2%、30℃發酵5d的條件下，蘋果汁的感官評分達到91分，發酵蘋果汁中總氨基酸和乳酸含量明顯增加，總SOD活性和總黃酮含量分別增加80.0%和16.9%，維生素C含量保持在80%以上。

關鍵詞：乳酸菌;鑒定;蘋果汁;發酵

中圖分類號：S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0202-05

作者簡介：潘勇（1992─），男，浙江麗水人，技術員，從事生物技術研究。E-mail：594696010@qq.com。

通信作者：郝之奎，博士，副教授，研究方向為微生物及生物質資源開發與利用。E-mail：haozhikui123@126.com。

蘋果是日常生活中的第一大水果，因味美且富含微量元素、維生素、果膠、類黃酮及蘋果多酚等營養或活性物質而深受大眾喜愛[1]。我國是世界最大蘋果種植國和產量國，年產蘋果4388余萬t[2]，與其他果品產業一樣，以鮮銷為主，深加工類品種單一，加工量占總產量比率低，產業水平和效益不高[3]。利用我國豐富的蘋果資源開展深加工研究，是提高蘋果產業效益和水平、增加蘋果附加值、豐富市場、滿足人民群眾需要的重要途徑。

乳酸菌是與人類可共存的一類有益微生物，大多存在于人體消化道內，對維持人體微生態平衡、提高人體免疫力起著重要作用[4]。隨著對乳酸菌的研究深入，其價值得到充分挖掘。日常生活所用的食材如豆制品、肉制品、果蔬等都可用于乳酸發酵基質，乳酸發酵對改良食品風味、提高營養價值有著重要作用，在食品發酵工業領域，乳酸已得到廣泛應用[5]。

本研究從蘋果樹根際土壤采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養基篩選產酸菌株，經形態和生理生化特征研究及分子生物學鑒定，將篩選的乳酸菌應用于蘋果汁發酵，通過工藝優化研究蘋果汁口感和營養成分變化，初步探索乳酸菌在制造蘋果汁發酵飲料中的應用。

1材料與方法

1.1材料與儀器

試驗于2017年11月至2018年4月在江南大學生物工程學院廖祥儒教授實驗室進行。試驗用蘋果根際土壤取自煙臺某蘋果園;樣本蘋果為市售鮮果;常用食品級麥芽糖、檸檬酸氫二銨等培養基添加試劑;T-SOD試劑盒和細菌基因組提取試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

所用設備為普通實驗室常用設備，分別為高效液相色譜儀[Agilent1260（安捷倫）]、高速離心噴霧干燥機（GEANiro）。

1.2培養基

試驗培養基主要是乳酸細菌培養基（MRS培養基）、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、多價蛋白胨-酵母膏培養基（PY培養基）。

1.3試驗方法

1.3.1菌株篩選

在MRS液體培養基中添加乳酸并調節pH值為5.5，加入適量土壤樣本，30℃恒溫搖床中低速培養14～18h，用滅菌水稀釋104倍、105倍、106倍，分別取100μL均勻稀釋液涂布于含有0.15%溴甲酚紫的MRS固體培養基平板上，倒置并在30℃條件下培養至形成菌落，挑選變黃菌落劃線純化至獲得純培養。

1.3.2菌株鑒定

1.3.2.1[JP3]菌株形態學觀察觀察研究30℃培養條件下形成的菌落特征和顯微形態學特征（革蘭氏染色）。

1.3.2.2菌株生理生化特征依據文獻[6-8]的方法研究所獲純培養的糖利用、產酸產氣、耐鹽、耐乙醇及七葉苷水解等生理生化特性。

1.3.2.3菌株16SrRNA基因序列分析利用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增純培養基因組，3%瓊脂糖電泳檢測并回收PCR擴增產物后測序（華大基因科技股份有限公司）。利用數據庫http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov，BLAST程序分析同源性并初步鑒定。

1.3.3菌株生長特性研究

1.3.3.1最適生長溫度的測定利用MRS培養基，5%接種量，設20、25、30、35、40℃等5個溫度梯度，60r/min搖床培養24h，采樣后測生物量（在600nm處測定吸光度D600nm），3個平行試驗，結果取平均值。

1.3.3.2最適生長pH值的測定

利用MRS培養基，5%接種量，設4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等9個pH值梯度，60r/min搖床培養24h，采樣后測生物量（在600nm處測定D600nm），3個平行試驗，結果取平均值。

1.3.3.3生長曲線和產酸能力的測定

利用MRS培養基，設5%接種量，60r/min搖床30℃培養，間隔2h采樣測定D600nm，研究所獲得純培養的生長和產酸特性[9]。

1.3.4菌株在蘋果汁發酵飲料中的初步應用

1.3.4.1發酵劑的制備把活化好的菌株按5%的接種量接種到MRS∶蘋果汁分別為4∶1、3∶2、2∶3、1∶4等4種比例的發酵培養基，60r/min搖床30℃培養24h，分別轉接至含1%蜂蜜的蘋果汁中30℃發酵，24h后得蘋果汁發酵劑。

1.3.4.2乳酸菌發酵蘋果汁飲料工藝流程

乳酸菌發酵蘋果汁飲料工藝流程為新鮮蘋果→清洗、去皮、去核→榨汁→護色（0.2%檸檬酸水）→滅菌（75℃，5min）→冷卻→加純凈水（蘋果汁含量30%）→加2%的蜂蜜→接入發酵劑（接種量5%）→靜止發酵（30℃，5d，起始pH值=7.0）→過濾→成品。

1.3.4.3蘋果汁發酵條件的優化（1）單因素試驗：依據“1.3.3.1”節試驗結果確定溫度，依據“1.3.4.2”節工藝，其他條件不變，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，以感官評分為指標對個樣本進行評價。依據“1.3.3.1”節試驗結果確定溫度，依據“1.3.4.2”節工藝，其他條件不變，蘋果汁含量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，以感官評分為指標對個樣本進行評價。依據“1.3.3.1”節試驗結果確定溫度，依據“1.3.4.2”節工藝，其他條件不變，蜂蜜添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，以感官評分為指標對個樣本進行評價。

（2）正交試驗：以接種量、蜂蜜添加量和蘋果汁含量為三因素，感官評分為指標，設計L9（33）正交試驗（表1），研究最佳發酵工藝條件。

1.3.4.4感官評定參考國標感官評定相關方法，隨機組織20位有感官評價經驗的人員從色、氣、味等設計評價標準（表2），取平均值作為結果。

1.3.4.5蘋果汁發酵前后主要成分的變化（1）氨基酸和有機酸含量測定：在最優發酵工藝條件下發酵蘋果汁，發酵前后氨基酸含量和有機酸（蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸）含量用高效液相色譜法測定[10]。

（2）總SOD活性、總黃酮含量和維生素C含量的測定：蘋果汁發酵前后采樣并制備10%的勻漿液，4000r/min離心10min，取上清液測總SOD活性;據GB/T12143—2008《飲料通用分析方法》附錄G的方法測定總黃酮含量;采用紫外分光光度法[11]測維生素C含量。樣品均重復3次取平均值。

2結果與分析

2.1菌株鑒定

2.1.1菌株形態特征

篩選獲得的純培養菌落大小懸殊，直徑為1～2mm，淡黃色，不透明，球形，邊緣整齊，中凸起，表面光滑，革蘭氏陽性（圖1）。

2.1.2生理生化特性參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步鑒定所獲純培養為植物乳桿菌屬（表3）。

2.1.3分子生物學研究

利用PCR儀擴增純培養基因組，由圖2可知，片段長度為1500bp左右，拖尾不明顯。測序后通過BLAST，與Lactobacillusplantarum的同源性可達99%。結合生理生化研究結果，初步確定該純培養為植物乳桿菌，并命名為LactobacillusplantrumasZ。

2.2LactobacillusplantrumasZ生長特性

2.2.1asZ的最適生長溫度及最適pH值最適溫度和最適pH值研究結果分別是30℃和6.5（圖3、圖4）。

2.2.2菌株生長曲線和產酸能力的測定

由圖5可知，asZ的停滯期在0～4h，對數生長期在4～12h，此階段D600nm值從0.1達到2.0，12h后進入穩定期。由圖6可知，asZ產酸能力強，發酵10h，pH值由6.5降至3.8，對數期產酸較為明顯。

2.3菌株LactobacillusplantrumasZ在蘋果汁發酵飲料中的應用

2.3.1蘋果汁發酵條件的優化

2.3.1.1單因素試驗（1）蘋果汁含量對發酵果汁感官的影響：將滅菌后的蘋果汁加純凈水分別配制成20%、30%、40%、50%、60%、70%含量的蘋果汁，再添加2%蜂蜜，起始pH值為7.0，接種量為5%，在30℃條件下發酵5d。由圖7可知，當蘋果汁含量38%時，其感官評分最高，故蘋果汁含量以35%、40%、45%作為正交試驗的3個水平。

（2）接種量對發酵蘋果汁感官的影響：適當提高接種量可以縮短微生物生長的延滯期，縮短發酵時間，由圖8可知，感官評分隨著接種量的增大呈現出先增高后降低的趨勢。當接種量理論值達到5.2%時，感官評分達到最高值87分，故以4%、5%、6%的接種量作為正交試驗的3個水平。

（3）蜂蜜添加量對發酵蘋果汁感官的影響：蜂蜜添加過少或過多會影響發酵飲料的酸甜感，如圖9所示，感官分值似乎有2個峰值，結合產業化成本因素，選擇1%、2%和3%的蜂蜜添加量作為正交試驗的3個水平。

2.3.1.2正交試驗

由表4可知，接種量對感官影響最大，蘋果汁含量次之，蜂蜜添加量影響最小，最佳培養條件為A1B2C2，即蘋果汁含量為35%，接種量為5%，蜂蜜添加量為2%，此時感官評分達到91分。

2.3.2蘋果汁發酵前后主要成分的變化

2.3.2.1氨基酸含量的變化發酵對總氨基酸含量變化影響明顯，發酵后總氨基酸提高了762.7%，其中脯氨酸提高最為明顯，達5946.7%，精氨酸增加3427.9%。只有亮氨酸比發酵前降低7.2%（表5）。

2.3.2.2有機酸含量的變化

由圖10可知，檸檬酸含量變化不大，蘋果酸含量下降明顯，發酵后有微量的乙酸產生，乳酸含量明顯增加，從發酵前的0.32mg/100mL增長到496.87mg/100mL，增長了1551.7倍。

[FK（W10][TPPY10.tif][

2.3.2.3總SOD活性、總黃酮含量和維生素C含量的測定

由表6可知，發酵后總SOD活性和總黃酮含量分別增加80.0%和16.9%，維生素C的含量有所減少，但保留80%，可能原因是發酵形成了低pH值環境維生素C，損失的維生素C可能作為底物利用。

3結論

生物技術的發展極大地拓寬了乳酸菌的應用領域，也為傳統水果的深加工提供了強大的技術支撐。乳酸菌在發酵過程中會產生多種酶，對所發酵的食材等底物起到降解、轉化作用，或通過乳酸本身的代謝產生多種新的物質，所以，通過發酵賦予了傳統水果新的口感和營養價值或新的功能。本研究利用稀釋涂布法，篩選獲得并鑒定了LactobacillusplantrumasZ。利用該菌株發酵了蘋果汁初步探索了發酵工藝條件，對開發以蘋果為原料的營養飲料做了有益嘗試。

從本研究結果來看，雖然蘋果汁的發酵產物營養成分有很大改善，但在功能方面還需要突出，比如通過發酵，在提高免疫力方面的功能還需要突出，這可能需要從改良發酵配方角度如添加幾丁質水解產物（N-乙酰基葡萄糖等）進一步深入研究。

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