杠板歸槲皮素提取工藝優化及體外抑菌效果

唐遠江 楊粵黔 周思璇 張濤 盧昱希 黃炳香

摘要：為優化杠板歸中槲皮素的最佳提取工藝，檢驗提取物體外抑菌活性，以槲皮素提取量為評價指標，采用Plackett-BurnmanDesign（PBD）設計聯合Box-BehnkenDesign（BBD）對槲皮素的提取工藝進行考察，并采用微量肉湯二倍稀釋法和瓊脂平板培養計數法研究提取物和槲皮素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌和殺菌作用。結果可知，最佳提取工藝為加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取時間3.4h，提取2次。提取物對3株細菌的最小抑菌濃度（MIC）介于3.12～6.31g/L，最小殺菌濃度（MBC）介于12.52～25.41g/L，槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，其殺菌效果不如提取物，對沙門氏菌的MIC和MBC均為3.27g/L，殺菌效果優于提取物。優化后的提取工藝穩定合理，且提取物具有良好抑菌活性。

關鍵詞：杠板歸;槲皮素;PBD;BBD;MIC;MBC

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0207-06

作者簡介：唐遠江（1987—），男，貴州遵義人，碩士，研究實習員，主要從事中獸藥研發。E-mail：tangyjjay0909@126.com。

通信作者：楊粵黔，副研究員，主要從事中獸藥研發。E-mail：252184152@qq.com。

杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸（PolygonumperfoliatumL.）的全草，民間習稱蛇倒退、貓爪刺、杠板歸等[1]，其主要成分有黃酮類、有機酸類、萜類等[2-6]。《中國獸藥典》2015版第二部中規定，槲皮素為杠板歸的主要成分[7]。現代藥理學研究表明，杠板歸具有抗菌、抗病毒、降血壓、抗腫瘤等作用[8-10]，臨床上杠板歸常用于治療慢性濕疹、乳腺炎、百日咳、瀉痢、黃疸、跌打腫痛等疾病。杠板歸的煎煮劑對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、炭疽桿菌等均有較強抑制作用，乙酸乙酯、正丁醇提取物對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用，75%乙醇提取物對多種細菌具有廣譜抗菌性[11-12]。槲皮素具有廣譜抗菌性，并且對革蘭氏陰性菌的抗菌作用強于革蘭氏陽性菌[13]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是引起畜禽細菌性疾病的常見致病菌[14-17]。因致病性細菌血清型眾多，難以制備出具有針對性的疫苗[18]。抗生素是治療此類疾病有效的手段，但長期使用抗生素導致致病菌的耐藥性嚴重，研究表明，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌對多種抗生素具有耐藥作用[19]。抗生素殘留可導致致病菌的耐藥性增強并轉移給人類，引起動物內源性感染和二重感染，使動物免疫力降低，抗原質量降低，降低疫苗的使用效果。尋找抗生素替代物和新途徑，消除或減輕禁用抗生素帶來的一系列影響，是我國畜牧業急需解決的問題[20]。

相比抗生素，中獸藥具有無殘留、不易產生耐藥性、價格便宜等優點，在畜牧養殖中的作用日趨重要[21]。2020年，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，使得中獸藥的發展迎來重大契機。前期研究發現，杠板歸汁液對大腸桿菌具有良好的抑菌活性，但未對其提取液進行研究。雖然杠板歸在臨床上的應用研究較多，但其有效成分的提取優化以及在獸醫上的開發應用較少。因此，為拓展中藥杠板歸的運用，筆者運用Plackett-BurnmanDesign（PBD）和Box-BehnkenDesign法（BBD）設計，優化建立杠板歸中槲皮素的提取工藝，并檢驗提取物的抗菌活性，以期為該中藥的開發和利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試菌株，大腸桿菌ATCC25922標準株、沙門氏菌ATCC13076標準株、金黃色葡萄球菌ATCC6538標準株，均由貴州省畜牧獸醫研究所獸用中草藥研究室保存;杠板歸分析樣品，由貴州省畜牧獸醫研究所獸用中草藥研究室提供，經貴州省畜牧獸醫研究所尚楊粵黔鑒定為PolygonumperfoliatumL.。槲皮素對照品，購于中國食品藥品檢定研究院，批號110957—201808;水解酪蛋白肉湯（MHbroth）和水解酪蛋白瓊脂（MHagar），購自廣州環凱微生物科技有限公司。其他試劑為色譜純或分析純。

1.2主要設備與儀器

LC-20型島津高效液相色譜儀（日本島津公司）、HH-4數顯恒溫水浴鍋（成都美普達儀器有限公司）、BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、潔拓超聲波清洗儀（深圳市潔拓超聲清洗設備有限公司）、DHG-9240A電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）、RE-5205型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3試驗方法

1.3.1槲皮素的定量檢測方法[7]

（1）色譜條件，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）為流動相;檢測波長為360nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進樣量10μL。

（2）對照品溶液的制備，取槲皮素對照品適量，精確稱定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得對照品溶液。

（3）供試品溶液的制備，取本品粉末（過三號篩）約0.7g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，精確加入甲醇-鹽酸（4∶1）混合溶液50mL，稱定質量，置90℃水浴中加熱回流1h，放冷，再稱定質量，采用甲醇補足減失的質量，搖勻、濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

（4）線性關系考察，精確稱取槲皮素對照品16.05mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別吸取對照品溶液1.6、3.2、7.8、12.5、17.2mL于50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得對照品質量濃度分別為10.00、20.50、50.00、80.02、110.40μg/mL，分別取各質量濃度標準品溶液10μL進樣，記錄色譜圖峰面積。以峰面積值（y）對對照品質量濃度（x）進行回歸，繪制標準曲線方程。

（5）精密度試驗，精確吸取槲皮素對照品溶液（20.50μg/mL）10μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的相對標準偏差（RSD）。

（6）穩定性試驗，取供試品溶液，于制備后0、1、2、4、8、12h分別進樣10μL，計算峰面積的RSD。

（7）重現性試驗，取杠板歸藥材6份，制備樣品供試品溶液，取供試品溶液進樣10μL檢測，計算槲皮素含量。

（8）加樣回收試驗，取已知含量（0.32mg/g）的樣品0.5g，共6份，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入槲皮素對照品溶液（20.50μg/mL）5mL，制備樣品供試品溶液，進行測定，以供試品溶液中對照品絕對質量分數計算加樣回收率。

1.3.2PBD篩選主要因素

取10g杠板歸采用水浴回流提取，取濾液檢測槲皮素含量，運用Minitab19進行PBD試驗。考察各個因素對槲皮素提取量的影響，試驗對A（浸泡時間）、B（乙醇體積分數）、C（溶劑量）、D（溫度）、E（提取時間）、F（提取次數）等6個主要因素進行評價，根據預試驗結果確定每個因素高（代碼：1）、低（代碼：-1）2個水平共12組試驗，篩選對槲皮素提取量的影響主要因子。PBD試驗因素和水平見表1。

1.3.3BBD試驗優化提取工藝

取10g杠板歸采用水浴回流進行提取，根據PBD試驗結果，以槲皮素含量（y）為目標響應值，選取乙醇體積分數（x1）、溶劑量（x2）和提取時間（x3）設計3因素3水平的響應面分析試驗，響應因素水平見表2。

1.3.4中藥提取物制備

稱取杠板歸中草藥200g粉末，采用優化后的工藝提取，合并提取液，過濾，烘干并粉碎，采用10%甲醇溶解并稀釋成不同濃度的溶液，相同方法配制槲皮素溶液，置于4℃冰箱中貯存，備用。

1.3.5菌液制備

將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于含MH液體培養基的試管中，置于37℃、200r/min條件下培養12h，并采用液體培養基將菌液的D600nm調整為0.8，再用培養基稀釋1000倍，相當于菌液濃度為105～106CFU/mL，保存備用。

1.3.6最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量肉湯二倍稀釋法，于無菌96孔板每一孔中均加入100μL肉湯，再分別向第一孔中加入100μL配備好的藥液，混勻后依次倍比稀釋，直到最后一孔混勻后棄去100μL混合液。每孔加入配備好的100μL細菌稀釋液，同時設置陽性對照組（加菌不加藥）和陰性對照組（不加菌不加藥）。在正式試驗之前設置有機溶劑對照組，即對每株菌進行有機溶劑的對照試驗，將藥液換成甲醇，保證所有供試菌株存活的最大溶劑含量，以便制備藥液所用的溶劑含量遠低于此值。將供試菌株37℃恒溫培養24h后取出，觀察細菌生長情況。每組試驗至少重復3次。

采用TTC法對MIC結果進行判定。向上述培養24h后的96孔板每孔分別加入20μL0.5%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃避光培養2h，觀察菌液的顏色變化。試驗組眼觀溶液澄清、顏色未發生變化的最低藥物質量濃度則作為該藥的MIC。

1.3.7最小殺菌濃度（MBC）的測定

將上述試驗組澄清的各孔中液體取100μL涂布于相應的營養培養基上，于37℃培養48h，以肉眼觀察無菌落生長的最低藥物質量濃度為其MBC[19]。

2結果與分析

2.1槲皮素定量檢測試驗的可靠性

線性關系試驗得出標準曲線方程為y=4×107x-35941，r2=0.9996，進樣濃度在10.00～110.40μg/mL，表明進樣濃度和峰面積線性關系良好。槲皮素對照樣品和檢測樣品的HPLC色譜圖見圖1。精密度試驗得出對照品平均峰面積為674579.33，RSD<2%，說明儀器精密性良好。穩定性試驗表明，槲皮素色譜峰面積RSD值為1.56%，樣品供試液在12h內穩定性良好。重現性試驗得出杠板歸樣品平均含量為0.31mg/g，RSD<2%，表明該樣品處理方法重現性好。加樣回收試驗表明，槲皮素平均回收率為99.73%，RSD為0.98%，說明本方法可靠、準確度好，符合含量測定的要求。

2.2影響杠板歸提取工藝的主要因素

按照PBD試驗設計，得到各處理組的槲皮素提取量（表3）。運用Minitab19軟件對各個因素進行顯著性分析，由表4可知，乙醇體積分數、溶劑量、提取時間對槲皮素提取量的影響顯著，浸泡時間、提取次數、溫度的影響不顯著。因此，選取乙醇體積分數、溶劑量、提取時間進行BBD試驗設計。

2.3槲皮素提取工藝回歸模型的建立

根據BBD試驗設計，得到不同水平條件下槲皮素的提取量（表5）。運用Designexpert10.3.2軟件，以槲皮素含量（y）為響應值分別對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，得到y對x1、x2和x3的二次多項回歸方程：y=0.322-0.0025x1+0.0001x2+0.015x3+0.0075x1x2-0.0075x1x3+0.0125x2x3-0.0322x21-0.0022x22-0.0173x23。模型F值為3.18，P<0.05，響應回歸模型顯著，失擬項P>0.05，失擬不顯著，由表6可知，根據模型擬合規律[22]，說明該回歸模型擬合程度較好。

2.4槲皮素最佳提取工藝的建立

以x1、x2、x3中任意1個變量固定，其余2個變量對y值作響應面圖（圖2）。根據曲面圖分析原理[23]，可以看出x1和x3對y值的交互作用不顯著，x1和x2，x2和x3對y值的交互作用明顯，根據回歸模型和曲面分析，得到槲皮素的最佳提取工藝為：加25倍59.92%體積分數乙醇，60℃下回流提取時間3.4h，提取2次，預測值y=0.33mg/g。

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2.5最佳提取工藝的驗證

取杠板歸適量，加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取3.4h，提取2次，按此工藝參數進行3次平行試驗，得到槲皮素平均提取量為0.34mg/g，由表7可知，槲皮素提取量與預測值相近，說明建立的提取工藝具有良好的可信度。

2.6杠板歸提取物和槲皮素的抑菌活性

由表8可知，杠板歸提取物和槲皮素對3株細菌均有抑制作用。提取物對3株細菌的MIC分別為3.12、6.24、6.31g/L，MBC分別為12.52、24.08、25.41g/L，槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，與杠板歸提取物的殺菌活性相比，槲皮素單體的殺菌效果不如提取物。槲皮素對沙門氏菌的MIC和MBC均為3.27g/L，說明沙門氏菌對槲皮素敏感，槲皮素對沙門氏菌的殺菌效果明顯優于杠板歸提取物。

3結論與討論

通過PBD和BBD試驗設計優化杠板歸中槲皮素的提取工藝，并進行抑菌活性檢驗，得到最佳提取工藝為：加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取時間3.4h，提取2次。提取物和槲皮素單體對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

在中藥有效成分提取中需考慮到多個單因素試驗以及試驗次數較多的正交設計，工作費時費力且具有盲目性，因此本試驗引用PBD設計。PBD是一種近飽和的2水平篩選試驗設計方法，通過比較各因子2水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，能用最少的試驗次數快速有效地篩選出顯著影響因子[24]。BBD具有結果直觀、預測性好的優點，試驗預測值能更好地考察參數合理性和試驗設計的準確性[25]。本研究通過驗證試驗，其驗證結果大于預測值，說明PBD聯合BBD設計在中藥提取中具有良好的可行性。

本試驗在篩選提取因素時藥材浸泡24h后槲皮素提取率有所提高，溫度對槲皮素提取的影響不明顯，溫度越高越不利于安全生產，且造成資源浪費，因此在響應面設計中不考慮加熱溫度的影響。同時，在提取過程發現提取2次可使有效成分完全浸出，故每個平行試驗均提取2次。通過檢測發現，本研究中供試藥材槲皮素的含量僅為0.32mg/g，貴州地區杠板歸藥材槲皮素的含量0.017～0.495mg/g[26]，說明供試藥材的有效成分含量合理。在槲皮素的提取報告中多采用甲醇-酸作為提取液，出于安全考慮，本試驗只采用乙醇作為提取液，且結果與甲醇-酸相差不大。杠板歸槲皮素的提取優化未有報道，沙芮以艾蒿為原料，得出槲皮素提取需加16倍甲醇[27]，與之相比，本研究只加25倍59.92%乙醇，更節約成本。

在抑菌活性研究中，槲皮素對沙門氏菌的MIC和MBC未超過3.30g/L，但高于滕楠報道的槲皮素對沙門氏菌的最低抑菌濃度2.17g/L[28]。槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.11、3.16g/L，MBC分別為100.18、50.56g/L，與秦曉蓉等的報道[13]相符。杠板歸提取物對大腸桿菌的抑菌活性最好，MIC和MBC分別為3.12、12.52g/L，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌MIC和MBC均未超過3.50、26.00g/L。黃學彬等研究得出，75%乙醇、乙酸乙酯和正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌等具有良好的抑菌效果[12]，說明杠板歸具有良好的藥用價值，值得進一步研究。

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