不同施肥處理對福建莆田地區枇杷根際微生物多樣性的影響

付龍威 湯曉娟 林授鍇 王春花 張艷珍 劉云國

摘要：福建莆田地區是我國枇杷的主產地之一。為探討復合肥對莆田地區枇杷根際土壤微生物的影響，利用高通量測序技術（IlluminaHiseq）研究4個采樣點的根際土壤細菌多樣性與土壤理化性質的相關性。結果顯示，在12份枇杷根際土壤樣品中共得到35371個細菌操作分類單元（OTU），屬于31個門，617個屬;共有12個優勢門（豐度>1%），其中豐度>6%的是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），25個優勢屬（豐度>1%）。在不同處理的根際土壤中各優勢菌門、屬所占比例存在明顯差異。土壤細菌群落結構和主要理化性質存在顯著相關性，其中pH值和全氮、有效磷、總磷含量是影響土壤細菌豐度的主要因素。

關鍵詞：枇杷;復合肥;高通量測序;根際土壤細菌多樣性;土壤理化性質

中圖分類號：S147.2;S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0261-07

作者簡介：付龍威（1993—），男，河南周口人，碩士，主要從事應用微生物研究。E-mail：445322966@qq.com。

通信作者：劉云國，博士，教授，主要從事食品微生物學研究。E-mail：yguoliu@163.com。

枇杷[Eriobotryajaponica（Thunb.）Lindl]是一種原產于我國的常綠薔薇科果樹，廣泛分布于亞熱帶地區。福建省莆田市是我國枇杷的主產區之一，該地區枇杷產量占全國枇杷總產量的1/3，枇杷栽培歷史悠久，其果肉柔軟多汁，營養豐富，酸度適中，風味極佳。由于連年大面積單一種植枇杷，土壤連作障礙問題日益突出;長期施用化肥導致了土壤板結、有效磷含量低[1]、微生物群落改變等一系列問題。土壤微生物是影響土壤生態過程的一個重要因素，與土壤養分循環[2]、有機質分解以及碳、氮等元素的轉化緊密關聯[3-4]，在維持土壤的質量和生態系統的穩定性方面發揮著重要作用。因而，研究莆田地區枇杷根際微生物的多樣性十分重要。

近年來，國內外在鹽爪爪[5-6]、翅堿蓬[7]、香蕉[8]、森林[9-10]等的根際微生物多樣性方面取得了一定研究進展。然而，莆田地區作為我國重要的枇杷產區之一，針對其枇杷根際微生物的研究鮮有報道。為研究施用復合肥對微生物群落造成的影響，本研究以福建省莆田地區的枇杷根際土壤為試驗對象，利用高通量測序技術（llluminaHiseq）對根際土壤微生物的菌群結構進行比較分析，以期為進一步了解莆田地區枇杷根際土壤微生物多樣性，探究微生物與土壤性質間的關系，以及解決莆田地區過度使用復合肥的問題，開發枇杷專用生物菌肥奠定基礎。研究結果將服務于“三農”，推進精準農業在枇杷種植方面的實施。

1材料與方法

1.1試驗設計

根據長期種植枇杷的果農的經驗，枇杷樹不能施用過多復合肥，否則會造成根部腐爛。本研究設制A、B、C、D4個采樣點，每年A采樣點每棵樹共施500g復合肥和20kg有機肥，B采樣點每棵樹共施400g復合肥和20kg有機肥，C采樣點每棵樹共施300g復合肥和20kg有機肥，D采樣點每棵樹共施200g復合肥和20kg有機肥，每年每個采樣點分4次施肥，連續施肥3年，第4年采樣1次。

1.2土樣采集

于2019年4月在莆田地區枇杷集中區根據不同的化肥施用量選取A、B、C、D4個采樣點。分別從4個取樣點選取間隔約10m的3棵編號依次為1、2、3，樹齡5年以上的枇杷（共12棵）的根部土壤進行5點取樣，每次取樣的土層厚度為0～30cm。每份土樣分為2個部分，一部分用于測定土壤理化性狀，另一部分提取DNA用于測序。

1.3土壤理化性質檢測

土壤pH值用pH計（土壤∶水=1g∶5mL）測定;有效鉀（AK）含量用乙酸銨提取，原子吸收分光光度法測定;有效磷（AP）含量、總磷（TOP）含量用碳酸氫鈉提取，鉬藍法測定;總鉀（TOK）含量用氫氟酸提取，原子吸收分光光度法測定;總氮（TON）含量用凱氏定氮法測定。

1.4土壤微生物的16SrRNA基因測序

1.4.1土樣DNA提取

稱取200mg土壤樣品，利用OMEGA土壤總DNA抽提試劑盒（E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit）提取土壤總DNA。

1.4.216SrRNA文庫構建

利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對提取的基因組DNA進行精確定量，以確定聚合酶鏈式反應（PCR）加入的DNA量。PCR引物為515F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNGTGCCAGCMGCCGCGGTAA;806R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACHVGGGTWTCTAAT，利用該引物對16SrRNA基因的V4區進行擴增。PCR結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對回收的DNA進行精確定量，以便按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10ng，最后使用IlluminaHiseqTM進行測序。

1.5生物信息學分析

對高通量測序得到原始數據進行拼接、過濾得到有效數據，然后基于有效數據進行操作分類單元（OTU）聚類和物種分類分析。采用QIIME（v.2.0-10）軟件進行α-多樣性分析，分析指標包括Chao1指數、Shannon指數、ACE指數。

1.6數據分析

利用Excel2010完成數據標準化處理及作圖，SPSS22.0軟件完成數據統計分析。

2結果與分析

2.1土壤理化性質分析

如表1所示，4個采樣點的根際土壤都呈弱酸性。A、B采樣地的土壤TON、AP、AK、TOP含量顯著高于C、D采樣地，D采樣地的TOK顯著低于A、B、C采樣地。

2.2樣本的有效序列數據量

使用Mothur軟件刪除了短小和質量低的序列后，在12個樣品中獲得614697條高質量序列，分配到35371個OTU（序列同一性為97%），利用R軟件處理得到OTU數目花瓣圖，從圖1可以看出，樣本間共有的有代表性的OTU有192個，不同樣本的代表OTU數量不一，其中，A3樣品的OTU數目最多，為592個;B1樣品的OTU數目最少，為85個。

2.3土壤細菌群落豐富度和多樣性分析

通過對16SrRNA基因的V4區進行測序，得到各采樣點土壤樣品的細菌群落多樣性數據。如表2所示，4個采樣點的OTU數目、ACE指數、Chao1指數均無顯著性差異，A采樣點的Shannon指數顯著低于B、C、D采樣點。

2.4多樣性指數與土壤理化因子相關性

如表3所示，Shannon指數與土壤pH值呈極顯著正相關，與TON、AP、TOP含量呈極顯著負相關;ACE指數與TOK含量呈顯著負相關;Chao1指數與pH值以及TON、AP、AK、TOP、TOK含量的相關性均不顯著。

2.5土壤微生物物種分類及樣本間差異

4個采樣點的土壤微生物共屬31個門，其中優勢門（除去未分類和其他，豐度均>1%）共有12個，如表4所示，A采樣點優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi），占比86.46%。B采樣點優勢菌門比A采樣點多了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、奇古菌門（Thaumarchaeota），占比之和為86.90%;C采樣點優勢菌門比A采樣點多了芽單胞菌門、奇古菌門、Latescibacteria，占比87.16%，D采樣點優勢菌門比A點多了芽單胞菌門、奇古菌門、Latescibacteria、candidatedivisionWPS-1，占比88.39%。4個采樣點優勢菌門平均豐度以變形菌門（36.45%）和酸桿菌門（23.46%）較高。A采樣點變形菌門的豐度顯著高于C、D采樣地，A采樣點的酸桿菌門、疣微菌門、擬桿菌、芽單胞菌門、candidatedivisionWPS-1、Latescibacteria豐度低于B、C、D采樣點。

4個采樣點共有617個屬的土壤微生物，其中根際土壤微生物群落優勢菌屬共有25個（單個優勢菌屬的豐度均>1%），4個采樣點共同含有的優勢菌屬有5個。如表5、表6、表7、表8所示，A采樣點的優勢菌屬有Gp6、Gp2、Gp1、Gp3、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、Massilia、鳥氨酸芽孢桿菌屬（Ornithinibacillus）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）、副球菌屬（Rhizomicrobium）、節桿菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas），占細菌總類群的28.31%。B采樣點的優勢菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gp2、Spartobacteriageneraincertaesedis、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudolabrys）和亞硝化球菌屬（Nitrososphaera），占細菌總類群的31.01%。C采樣點的優勢菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gaiella、Gp2、Spartobacteriageneraincertaesedis、[JP3]Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、硝化螺菌屬（Nitrospira）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、出芽菌屬（Gemmata）和Latescibacteriageneraincertaesedis，占細菌總類群的35.32%。D采樣點的優勢菌屬有芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）、Gp6、Gaiella、Gp2、[JP3]Spartobacteriageneraincertaesedis、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4、WPS-1generaincertaesedis、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、Gp7和Latescibacteriageneraincertaesedis，占細菌總類群的38.16%。優勢菌屬的豐度與復合肥的用量呈負相關，說明復合肥的過度使用會降低微生物多樣性。

2.6細菌門豐度與土壤理化性質的相關性分析

4個采樣點共同含有的8種優勢細菌門（豐度>1%）豐度和根際土壤的理化性質相關性如表9所示，變形菌門豐度與pH值呈極顯著顯著負相關，與氮、磷、鉀含量呈正相關，其中與TON、AP、AK、TOP含量呈顯著正相關。酸桿菌門是所有土壤樣品中豐度位居第2的菌門，與pH值呈極顯著正相關，與TON、AP、TOP含量呈極顯著或顯著負相關。厚壁菌門豐度與總氮含量呈顯著正相關。浮霉菌門豐度與TON含量呈顯著負相關。疣微菌門與pH值呈顯著正相關，與TON、AP、TOP含量呈極顯著負相關，與AK、TOK含量呈顯著負相關。擬桿菌門豐度與pH值呈顯著正相關，與TOP含量呈顯著負相關。

3討論

不同的施肥處理主要影響了土壤pH值以及全氮、有效磷、總磷含量等指標，4個試驗點通過連續4年的不同施肥處理，不同無機肥施用量下土壤pH值有顯著差異，其中無機肥施用量最多的處理pH值最低，這是因為長期大量施用復合肥能降低土壤pH值[11-12]。有機肥處理對土壤的氮、磷、鉀含量的影響不大[13-14]，所以無機肥的施用量是造成土壤pH值以及氮、磷、鉀含量不同的主要因素。

大量無機肥料特別是氮肥的投入，通常會導致旱地土壤細菌多樣性減少[15]。本研究結果顯示，A采樣點的Shannon指數最低，且與其他地區差異顯著，這與Geisseler等的研究結果[16-17]相符。土壤pH值常被認為是長期施用無機肥土壤中影響細菌生物多樣性的主要因素[11，16]。總體來看，細菌生物豐度與TON、AP、AK、TOP、TOK含量呈顯著負相關，說明長期施用無機肥后，氮、磷、鉀對根基微生物有一定的抑制作用。Delgado-Baquerizo等的研究結果表明，土壤理化指標對細菌生物多樣性有一定的驅動作用[18]。土壤氮、磷是決定細菌群落結構的重要因素，本研究中總氮含量與Shannon指數呈顯極著負相關，表明氮肥的過度使用降低了土壤微生物多樣性[19-20];在我國亞熱帶地區，由于風化和土壤流失，酸性水稻土壤中的磷含量很低[15，21]，枇杷生長過程中不需要很多水分，因此土壤中磷的流失較少，含量相對豐富。已有研究報道，施加高磷肥料直接改變了植物土壤微生物群落結構[21-22]。綜合來看，本研究中Shannon指數與pH值呈極顯著正相關，與TON、AP、TOP含量均呈極顯著負相關，與AK、TOK含量呈負相關，說明長期施用復合肥會降低土壤微生物多樣性。

本研究通過對不同施肥處理下土壤微生物門豐度進行聚類分析發現，施用復合肥量最多的A采樣點的優勢門個數最少，且優勢菌門較為集中，變形菌門豐度為48.51%，明顯高于其他處理。變形桿菌門細菌具有固氮功能，變形桿菌門豐度增加有利于土壤氮素的有效轉化[23]，氮循環過程對土壤pH值存在影響[24]。枇杷根際土壤細菌群落中變形菌門和酸桿菌門占主導地位，與該土壤呈酸性有關。河北省中南部地區耕地[25]、蘋果園土壤[26]、酸性土壤[27]的根際微生物優勢菌門一致。變形菌門被認為是世界上微生物最豐富的菌門，是多數土壤中的優勢門類，與碳循環有關[28]。酸桿菌門多存在于營養貧瘠的土壤環境中[29]，Barns等研究表明，酸桿菌門是土壤細菌群落第2優勢門，僅次于變形菌門[30]，與本研究結果與之一致。

采樣地土壤微生物在屬水平上的差異很大，莆田地區4個采樣點共同的菌屬有Gp6、Gp2、Gp1、Subdivision3generaincertaesedis、Gp4。隨著復合肥用量的增加，優勢菌屬豐度在減少，但是由于A采樣點長期施肥量較多，導致Massilia、鳥氨酸芽孢桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、副球菌屬、節桿菌屬、假單胞菌屬細菌出現適應現象，成為A采樣點的優勢菌屬。芽孢桿菌屬廣泛存在于土壤、水、植物及動物活動環境中，營養要求低，代謝能力強，可以耐受不良環境條件，部分芽孢桿菌對病原菌有一定的拮抗作用[31]。芽孢桿菌屬對洋蔥遭受銅脅迫具有緩解作用[32]，該屬除了具有良好的解磷能力，還具有良好的固氮作用和生防作用[33]。后續可有目的性地篩選優勢菌，制成生物菌肥解決莆田地區過度施復合肥的問題。

相關性分析發現，土壤pH值對變形菌門和酸桿菌門細菌豐度影響明顯，總氮、速效磷、總磷含量對變形菌門豐度有顯著影響。在迄今已知的與土壤中酸性細菌豐度相關的環境因素中，pH值為影響最為突出的因素[34-35]，本研究相關性分析結果與之一致。pH值和氮、磷、鉀含量會影響細菌的分布，羅旦等對沙漠環境植物根際微生物的研究結果表明，變形菌門的豐度與有效氮、AP含量顯著正相關[36]。土壤全氮、全磷含量是影響土壤變形菌的關鍵因子[37]，本研究結果與之一致。厚壁菌門分布與TON含量呈顯著正相關，與pH值以及磷、鉀含量的相關性不顯著，與Navarrete等對大豆根際土壤的研究結果[38]類似。相關性分析發現，土壤pH值對變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和疣微菌門影響顯著。

本研究充分了解了短期內使用大量復合肥引起pH值下降對枇杷根際土壤微生物多樣性、結構以及功能造成的影響，為以后研發生物菌肥以及解決土壤板結、酸化問題提供理論依據。

參考文獻：

[1]傅麗君，楊文金，林文郴，等.莆田市常太枇杷園土壤肥力與果樹營養狀況測定[J].莆田學院學報，2005，12（5）：41-43.

[2]NannipieriP，Ascher-JenullJ，CeccheriniMT，etal.Microbialdiversityandsoilfunctions[J].EuropeanJournalofSoilScience，2003，54（4）：655-670.

[3]TeboBM，JohnsonHA，McCarthyJK，etal.Geomicrobiologyofmanganese（Ⅱ）oxidation[J].TrendsMicrobiol，2005，13（9）：421-428.

[4]李小霞，靳鯤鵬，曹晉軍，等.輪作制度對土壤生態的影響研究進展[J].現代農業科技，2019（6）：154-155，159.

[5]陳禹竹，唐琦勇，顧美英，等.鹽爪爪根部微生物分布特征及鹽濃度對碳源代謝分析的影響[J].微生物學通報，2019，46（11）：2900-2908.

[6]木尼熱木·阿力木江，楚敏，唐琦勇，等.輻射污染區鹽爪爪根際可培養細菌群落組成及功能特性[J].微生物學通報，2018，45（7）：1416-1425.

[7]李志杰，郭長城，石杰，等.高通量測序解析多環芳烴污染鹽堿土壤翅堿蓬根際微生物群落多樣性[J].微生物學通報，2017，44（7）：1602-1612.

[8]游曉朝.香蕉枯萎病拮抗菌株篩選及生防菌肥研發[D].泉州：華僑大學，2018.

[9]NaveedM，MubeenS，KhanSU，etal.Identificationandcharacterizationofrhizosphericmicrobialdiversityby16SribosomalRNAgenesequencing[J].BrazilianJournalofMicrobiology，2014，45（3）：985-993.

[10]MengMJ，LinJ，GuoXP，etal.Impactsofforestconversiononsoilbacterialcommunitycompositionanddiversityinsubtropicalforests[J].Catena，2019，175：167-173.

[11]DaiZM，SuWQ，ChenHH，etal.Long-termnitrogenfertilizationdecreasesbacterialdiversityandfavorsthegrowthofActinobacteriaandProteobacteriainagro-ecosystemsacrosstheglobe[J].GlobalChangeBiology，2018，24（8），3452-3461.

[12]ZhouJ，GuanDW，ZhouBK，etal.Influenceof34-yearsoffertilizationonbacterialcommunitiesinanintensivelycultivatedblacksoilinnortheastChina[J].SoilBiologyandBiochemistry，2015，90：42-51.

[13]LiuEK，YanCG，MeiXR，etal.Long-termeffectofchemicalfertilizer，straw，andmanureonsoilchemicalandbiologicalpropertiesinnorthwestChina[J].Geoderma，2010，158（3/4）：173-180.

[14]李想，劉艷霞，陳風雷，等.長期不同施肥處理對貴州植煙土壤酶活及微生物群落的影響[J].中國煙草學報，2019，25（6）：50-59.

[15]ZhengSX，CaoHC，HuangQY，etal.Long-termfertilizationofPcoupledwithNgreatlyimprovedmicrobialactivitiesinapaddysoilecosystemderivedfrominfertileland[J].EuropeanJournalofSoilBiology，2016，72：14-20.

[16]GeisselerD，ScowKM.Long-termeffectsofmineralfertilizersonsoilmicroorganisms-Areview[J].SoilBiologyandBiochemistry，2014，75：54-63.

[17]LiuYX，ShiJX，FengYG，etal.Tobaccobacterialwiltcanbebiologicallycontrolledbytheapplicationofantagonisticstrainsincombinationwithorganicfertilizer[J].BiologyandFertilityofSoils，2013，49（4）：447-464.

[18]Delgado-BaquerizoM，ReichPB，KhachaneAN，etal.Itiselemental：soilnutrientstoichiometrydrivesbacterialdiversity[J].EnvironmentalMicrobiology，2017，19（3），1176-1188.

[19]劉倩倩.長期秸稈還田配施氮肥對砂姜黑土肥力及細菌多樣性的影響[D].阜陽：阜陽師范學院，2019.

[20]聶江文，王幼娟，吳邦魁，等.雙季稻田冬閑期土壤細菌數量及結構對施氮的響應[J].植物營養與肥料學報，2019，25（6）：889-896.

[21]SuJQ，DingLJ，XueK，etal.Long-termbalancedfertilizationincreasesthesoilmicrobialfunctionaldiversityinaphosphorus-limitedpaddysoil[J].MolecularEcology，2015，24（1），136-150.

[22]WeiXM，HuYJ，PengPQ，etal.EffectofPstoichiometryontheabundanceofnitrogen-cyclegenesinphosphorus-limitedpaddysoil[J].BiologyandFertilityofSoils，2017，53（7），767-776.

[23]MoulinL，MuniveA，DreyfusB，etal.Nodulationoflegumesbymembersoftheβ-subclassofproteobacteria[J].Nature，2001，411（6840）：948-950.

[24]RingE，HogbomL，JanssonG.Effectsofpreviousnitrogenfertilizationonsoil-solutionchemistryafterfinalfellingandsoilscarificationattwonitrogen-limitedforestsites[J].CanadianJournalofForestResearch，2013，43（4）：396-404.

[25]張翔，宋水山，黃亞麗，等.基于高通量測序分析河北省中南部地區耕地土壤細菌多樣性[J].華北農學報，2018，33（4）：196-203.

[26]WangL，LiJ，YangF，etal.Applicationofbioorganicfertilizersignificantlyincreasedappleyieldsandshapedbacterialcommunitystructureinorchardsoil[J].MicrobialEcology，2017，73（2），404-416.

[27]任慶水.三峽庫區消落帶不同人工植被土壤微生物群落多樣性[D].重慶：西南大學，2018.

[28]LiuJJ，SuiYY，YuZH，etal.HighthroughputsequencinganalysisofbiogeographicaldistributionofbacterialcommunitiesintheblacksoilsofNortheastChina[J].SoilBiologyandBiochemistry，2014，70：113-122.

[29]ZhangYG，CongJ，LuH.CommunitystructureandelevationaldiversitypatternsofsoilAcidobacteria[J].JournalofEnvironmentalScience，2014，26（8）：1717-1727.

[30]BarnsSM，TakalaSL，KuskeCR.WidedistributionanddiversityofmembersofthebacterialkingdomAcidobacteriumintheenvironment[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1999，65（4）：1731-1737.[HJ2.08mm]

[31]姚麗瑾，王琦，付學池，等.小麥紋枯病生防芽孢桿菌的篩選及鑒定[J].中國生物防治，2008，24（1）：53-57.

[32]任彩婷，王魯，龐亞琴，等.2種芽孢桿菌屬細菌對洋蔥根系遭受銅脅迫的緩解作用[J].天津師范大學學報（自然科學版），2018，38（6）：36-41.

[33]張艷群.功能型生物肥料優良芽孢桿菌的篩選及其作用機理研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2013.

[34]JonesRT，RobesonMS，LauberCL，etal.AcomprehensivesurveyofsoilAcidobacterialdiversityusingpyrosequencingandclonelibraryanalyses[J].ISMEJ，2009，3（4）：442-453.

[35]GrifthsRI，ThomsonBC，JamesP，etal.ThebacterialbiogeographyofBritishsoils[J].EnvironmentalMicrobiology，2011，13（6）：1642-1654.

[36]羅旦，陳吉祥，程琳，等.陜北沙化區3種主要植物根際土壤細菌多樣性與土壤理化性質相關性分析[J].干旱區資源與環境，2019，33（3）：151-157.

[37]劉洋，黃懿梅，曾全超.黃土高原不同植被類型下土壤細菌群落特征研究[J].環境科學，2016，37（10）：3931-3938.

[38]NavarreteAA，KuramaeEE，deHollanderM.AcidobacterialcommunityresponsestoagriculturalmanagementofsoybeaninAmazonforestsoils[J].FEMSMicrobiolEcology，2013，83（3）：607-621.