缺氧預(yù)處理人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞外囊泡的microRNAs 表達(dá)譜分析

邊素艷，劉姍姍，劉宏斌，朱啟偉

解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心，國家老年醫(yī)學(xué)臨床研究中心，心血管內(nèi)科，北京 100853

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)作為一種多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，且MSC 取材方便、體外擴(kuò)增容易，免疫源性低，被認(rèn)為是組織工程研究及轉(zhuǎn)化的理想種子細(xì)胞。機(jī)制研究表明，MSC 釋放的細(xì)胞外囊泡(extracelluar vesicles，EVs)可能是其與靶器官信號傳遞的重要介質(zhì)，發(fā)揮著促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，是MSC 組織損傷修復(fù)的重要機(jī)制之一[1-2]。在不同環(huán)境下，MSC 釋放的EVs 中所包含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、microRNAs 等內(nèi)容物不同[3-4]。研究不同應(yīng)激條件下MSC 釋放EVs 的生物信息分子表達(dá)情況，對研究MSC 的功能及分子調(diào)控機(jī)制，選擇性地改造MSC-EVs，使其具有特殊的功能，具有一定的實(shí)用價值。既往研究表明，缺氧(5% O2)預(yù)處理能增強(qiáng)臍帶MSC 的增殖、遷移活性，并維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)[5-7]。缺氧預(yù)處理還可提高M(jìn)SC 在宿主體內(nèi)的生存和促血管新生能力[5,8]。我們的前期研究也表明，體外培養(yǎng)的MSC(大鼠骨髓MSC、人臍帶MSC)在低氧和無血清預(yù)處理后，可以釋放更多的外泌體；而且這種外泌體，與MSC一樣，具有促進(jìn)體內(nèi)外血管生成的作用，改善心肌梗死大鼠缺血心肌的血液灌注和心功能[9-10]。為了解缺氧預(yù)處理MSC 促進(jìn)組織修復(fù)功能的分子機(jī)制，本研究擬對缺氧預(yù)處理MSC 分泌的EVs 進(jìn)行microRNAs 表達(dá)譜，以及差異microRNAs 的基因、功能、分子通路等生物信息學(xué)分析，為深入研究MSC-EVs 的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

材料和方法

1 試劑與儀器 人骨髓MSC 購自上海拜力生物科技有限公司。α-MEM 培養(yǎng)基(Gibico，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；Trizol(美國英杰生命技術(shù)有限公司)；CO2氣體恒溫培養(yǎng)箱及低氧培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；R450 型酶標(biāo)儀(伯樂，美國)；超高速離心機(jī)(貝克曼，美國)；7900HT 實(shí)時PCR系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng))。

2 人骨髓MSC 的培養(yǎng)及缺氧預(yù)處理 生長狀態(tài)良好的P3 ～ P5 代人骨髓MSC，按照5×106/皿接種于直徑為150 mm 的培養(yǎng)皿中，在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，預(yù)先經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，1×105g 離心16 h，去除FBS 中外泌體)的α-MEM 中，37℃、5% CO2、95%濕度下常規(guī)培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。次日始去除培養(yǎng)基，換用無血清α-MEM 培養(yǎng)基，置于低氧培養(yǎng)箱中(1% O2，5% CO2，94% N2)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3 MSC-EVs 的制備 收集培養(yǎng)48 h 后的MSC 上清，用超速離心方法收集EVs[9]：細(xì)胞上清液在4℃以1 500 g 離心5 min 去除細(xì)胞碎片及蛋白顆粒，再經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后，于4℃、1×105g 離心60 min，棄上清，得到EVs沉淀，用Apop緩沖液(含5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，136 mmol/L NaCl)清洗2 次，重懸于50μL Apop 緩沖液中，分成5μL 的等份，存儲在-80℃下用于以下實(shí)驗。本研究所用EVs 來源于3 個樣本培養(yǎng)的MSC。

4 microRNAs 微陣列分析 用Trizol 試劑從3 個獨(dú)立制備的MSC 和MSC-EVs 中分離RNA，然后在7900HT 實(shí)時PCR 系統(tǒng)上用TaqMan 低密度陣列(TLDA，Invitrogen，USA) 進(jìn)行microRNAs 微陣列分析，由上海其明生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)數(shù)據(jù)，應(yīng)用隨機(jī)方差模型(random variance model)t 檢驗篩選差異表達(dá)的microRNAs。在顯著性分析和誤判率(false discovery rate，F(xiàn)DR)分析之后，根據(jù)P ＜0.05 選擇差異表達(dá)的microRNAs[11]。

5 差異microRNAs 靶基因的預(yù)測 利用TargetScan和miRanda 數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測microRNAs 的靶基因。TargetScan 預(yù)測的靶基因數(shù)量為5 270 個，miRanda 預(yù)測的靶基因數(shù)量為15 663個，將TargetScan 與miRanda 預(yù)測的靶基因取交集后得到交集靶基因數(shù)量為3 759 個。

6 功能顯著性分析—GO 分析 將兩組之間的差異microRNAs 預(yù)測的靶基因基于Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(簡稱GO 數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行基因功能注釋，得到靶基因參與的所有功能[12]，而后利用Fisher 精確檢驗和χ2檢驗計算每個功能的顯著性水平(P)和FDR，篩選出靶基因所體現(xiàn)的顯著性功能[13]。顯著性篩選的標(biāo)準(zhǔn)：P ＜0.05，F(xiàn)DR ＜0.05。

7 Pathway 分析 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，對靶基因利用Fisher 精確檢驗和χ2檢驗，把目標(biāo)基因參與的Pathway 進(jìn)行顯著性分析，根據(jù)P ＜0.05 進(jìn)行篩選，得到顯著性的Pathway[14-16]。

8 microRNAs 與交集靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(microRNA-Gene-Network) 通過靶基因的功能顯著性分析和Pathway 的顯著性分析，得到顯著性的GO 和Pathway 及其所屬的基因，而后取顯著性GO 所屬靶基因與顯著性Pathway 所屬的靶基因的交集，根據(jù)microRNAs 和靶基因的這部分交集的屬性，利用microRNAs 與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建microRNA-Gene-Network。

9 基于靶基因功能分析的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(microRNAGO-Network) 結(jié)合基因功能數(shù)據(jù)庫和靶向序列分析技術(shù)，將上一步分析中得到的顯著性GO 與差異microRNAs 構(gòu)建MicroRNA-GO-Network，篩選出在實(shí)驗處理后的關(guān)鍵microRNAs 及microRNAs 調(diào)控的靶基因的主要功能。

10 統(tǒng)計學(xué)分析 所有結(jié)果采用SPSS11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用成組t 檢驗或單因素方差分析。兩分類的差異基因篩選使用隨機(jī)方差模型的t 檢驗或F 檢驗。GO、Pathway分析采用Fisher's精確概率檢驗和χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 microRNAs 的表達(dá)譜分析 microRNAs 微陣列結(jié)果顯示，MSC-EVs 中至少表達(dá)223 種microRNAs，MSC 中 至 少 有526 種microRNAs。MSC-EVs 中檢測到的microRNAs 均存在于MSC，但二者microRNAs 表達(dá)水平存在差異。與MSC 相比，MSC-EVs 中共有98 種差異表達(dá)microRNAs，包括31 種表達(dá)上調(diào)，67 種表達(dá)下調(diào)的microRNAs(P ＜0.05，圖1)。前15 位差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的microRNAs 見表1。

2 差異microRNAs 對應(yīng)靶基因的顯著性功能分析(GO-Analysis) 顯著性GOs 分析表明，MSC-EVs中上調(diào)microRNAs 的顯著性細(xì)胞功能包括細(xì)胞分化、運(yùn)輸、MAPK 活性的失活、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞周期等。相反，與下調(diào)microRNAs 相對應(yīng)的重要GOs 包括細(xì)胞分化、運(yùn)輸、細(xì)胞周期、對刺激的反應(yīng)、內(nèi)吞作用。見圖2。

3 差異microRNAs 對應(yīng)靶基因的顯著性Pathway分析 對MSC-EVs 差異microRNAs 調(diào)控靶基因的Pathway 進(jìn)行分析，上調(diào)microRNAs 調(diào)控的重要通路包括局灶性黏附、胰島素信號途徑、erbB 信0號途徑、MAPK 信號途徑、趨化因子信號途徑等。下調(diào)microRNAs 調(diào)控的重要通路包括MAPK 信號通路、erbB 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、局灶性黏附、mTOR 信號通路等。見圖3。

表1 MSC-EVs 中前15 位差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的microRNAsTab. 1 The top 15 differentially expressed microRNAs in MSC-EVs compared with MSC

4 microRNAs 靶向調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)(microRNAGene-Network) 網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控mRNA 最多的前5 位下 調(diào)microRNAs 有has-miR-93-5p、has-miR-19b-3p、has-miR-23b-3p、has-miR-34a-5p 和has-miR-185-5p，分別調(diào)控193、142、126、102和37 種mRNA；調(diào)控mRNA 最多的前5 位上調(diào)microRNAs 有has-miR-149-3p、has-miR-4763-3p、has-miR-762、has-miR-4492 和has-miR-3135b，分別調(diào)控86、79、63、60 和44 種mRNA。網(wǎng)絡(luò)中被microRNAs 調(diào)控最多的前5 位靶基因包括RORA、IQSEC2、CBL、DPYSL5、VPS37D，分別由7、7、6、6、6 個microRNAs 調(diào)控。見圖4。

圖 1 MSC-EVs和MSC中microRNAs的差異表達(dá)譜熱圖。綠色或紅色條分別表示樣品中特異性microRNAs水平下調(diào)或上調(diào)Fig. 1 A heat map comparing expression of microRNAs between MSC-EVs and MSC. Green or red bars indicate that the level of specific microRNAs in the sample was down-regulated or up-regulated, respectively

圖 2 基于差異microRNAs對應(yīng)靶基因的GO分析(GO-Analysis)?？v軸是差異功能名稱，橫軸是功能的豐度Fig. 2 GO analysis based on differential microRNAs targeted genes. The vertical axis is the GO category, and the horizontal axis is the enrichment of GO

圖 3 基于差異microRNAs對應(yīng)靶基因的Pathway分析(Pathway-Analysis)?？v軸是差異功能名稱，橫軸是通路的豐度Fig. 3 Pathway analysis based on differential microRNAs targeted genes. The vertical axis is the Pathway category, and the horizontal axis is the enrichment of Pathway

5 microRNAs 靶向調(diào)控功能網(wǎng)絡(luò)(microRNA-GONetwork) 對差異microRNAs 與第四步中的顯著性功能進(jìn)行迭代相關(guān)，構(gòu)建microRNAs 與靶基因功能的網(wǎng)絡(luò)，得到在網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控作用的microRNAs 及其調(diào)控的關(guān)鍵功能。網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的前5 位microRNAs 包 括hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsamiR-4763-3p，分別參與調(diào)控51、42、42、42、33種細(xì)胞功能。細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)和誘導(dǎo)凋亡是被microRNAs 調(diào)控最多的前5 位細(xì)胞功能，分別由23、21、19、18、16 個microRNAs 調(diào)控。見圖5。

圖 4 microRNAs基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(microRNA-Gene-Network)。圖中圓角矩形代表microRNA(紅色標(biāo)注的是上調(diào)，藍(lán)色標(biāo)注的是下調(diào))，灰色圓圈代表gene，直線代表microRNA與gene的調(diào)控關(guān)系Fig. 4 microRNA-gene-network. In the figure, the rounded rectangle nodes represent microRNAs (red indicates up-regulation, blue indicates down-regulation), gray circle node represents gene, and straight lines describe regulatory relationship between microRNA and gene

圖 5 microRNAs功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(microRNA-GO-Network)。圖中正方形和六邊形代表microRNA(紅色標(biāo)注的是上調(diào)，藍(lán)色標(biāo)注的是下調(diào))，灰色圓圈代表GO功能，直線代表microRNA與GO的調(diào)控關(guān)系Fig. 5 microRNAs-GO-Network. In the figure, the square and hexagon represent microRNAs (red indicates up-regulation, blue indicates down-regulation), gray circle node represents GO, and straight lines describe regulatory relationship between microRNA and GO

討 論

本研究分析了缺氧預(yù)處理的MSC-EVs 的microRNAs 表達(dá)譜，并通過生物信息分析，篩選出一些缺氧預(yù)處理后MSC-EVs 中差異表達(dá)的microRNAs，預(yù)測了它們的靶基因，及其調(diào)控的細(xì)胞功能及分子通路，為進(jìn)一步研究缺氧預(yù)處理后MSC 的組織修復(fù)功能及相關(guān)機(jī)制，尋找替代MSC 移植的功能增強(qiáng)型EVs，提供了生物信息學(xué)研究基礎(chǔ)。

越來越多的研究表明，MSC 的再生作用可能由其來源的EVs(包括微泡或外泌體等)介導(dǎo)完成，如MSC-EVs可促進(jìn)急性腎損傷小鼠的功能修復(fù)[17]，促進(jìn)肝切除大鼠的肝再生[18]，縮小缺血心臟的梗死面積[19]、調(diào)節(jié)心肌重塑[20]。EVs 可能通過受體-配體相互作用，傳遞表面受體、生物活性脂質(zhì)、信號分子、microRNAs、mRNA 等至靶細(xì)胞，從而調(diào)控靶細(xì)胞的功能[21-24]。

EVs 介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是一種新的細(xì)胞間遺傳交換機(jī)制[3]。Collino 等研究發(fā)現(xiàn)成人骨髓和組織特異性MSC 可選擇性分泌microRNAs，上百個與不同功能相關(guān)的基因被報道參與這一過程。然而，EVs 中的內(nèi)含物并不是隨機(jī)的，細(xì)胞在不同的狀態(tài)分泌的EVs 組成成分不同，這一過程由復(fù)雜的分選系統(tǒng)來調(diào)控[4]。MSC 分泌EVs 也較為復(fù)雜，受培養(yǎng)條件、細(xì)胞活力等多種因素影響。

氧濃度是影響MSC 細(xì)胞生物學(xué)的一個重要因素[25]。缺氧刺激使細(xì)胞處于活化/應(yīng)激狀態(tài)，可分泌大量的外泌體[9,26]。缺氧可促進(jìn)細(xì)胞釋放一種救命信號，通過機(jī)制復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和信號蛋白表達(dá)，以促進(jìn)機(jī)體啟動緊急修復(fù)程序，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖，DNA 修復(fù)和凋亡等適應(yīng)性改變。其中，較為重要的是缺氧可引起一系列特殊的microRNAs 表達(dá)改變(被稱為Hypoxamirs)，表現(xiàn)在：1)缺氧對Hypoxamirs 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控：在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxiainducible factor，HIF)等轉(zhuǎn)錄因子被上調(diào)，并直接激活部分Hypoxamirs 的轉(zhuǎn)錄，或選擇性抑制部分Hypoxamirs。2)低氧也通過表觀遺傳調(diào)控如控制特異性microRNAs 轉(zhuǎn)錄的DNA 去甲基化。3)缺氧可調(diào)節(jié)控制microRNAs 成熟和活性中轉(zhuǎn)錄后事件的關(guān)鍵蛋白的活性。提示缺氧是microRNAs 生物生成和功能的重要調(diào)控因子[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理MSC 所分泌的EVs中microRNAs 表達(dá)譜與母細(xì)胞中microRNAs 存在差異。MSC-EVs 中表達(dá)223 種microRNAs，而MSC 中表達(dá)526 種microRNAs。除了表達(dá)種類不同外，表達(dá)量存在顯著差異的microRNAs 有98 種，包括31 種表達(dá)上調(diào)，67 種表達(dá)下調(diào)的microRNAs。有趣的是，MSC-EVs 中所有microRNAs 均來自MSC，但具有一定的選擇性，這可能與HIF 等轉(zhuǎn)錄因子對Hypoxamirs 轉(zhuǎn)錄、成熟和功能的調(diào)控有關(guān)。這些差異表達(dá)的microRNAs 可能與缺氧預(yù)處理后MSC 的功能相關(guān)。

繼而，我們對差異microRNAs 預(yù)測的靶基因進(jìn)行了后續(xù)功能學(xué)分析，結(jié)果顯示EVs 中差異microRNAs 中優(yōu)先調(diào)控的生物學(xué)功能包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)和凋亡，這些與細(xì)胞命運(yùn)和分化有密切關(guān)系，提示其在組織損傷的修復(fù)中起重要作用。而這些功能的實(shí)現(xiàn)，最可能參與的調(diào)控通路有局灶性黏附、erbB 信號途徑、MAPK 信號途徑等。

細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間黏附功能，是細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化增殖與分化以及細(xì)胞的伸展與轉(zhuǎn)移的重要分子基礎(chǔ)，參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移等一系列重要生理和病理過程。細(xì)胞遷移增加可導(dǎo)致MSC 在組織修復(fù)和再生過程中的募集。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)是廣泛存在于動植物細(xì)胞中的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其作用主要是將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞的生物化學(xué)反應(yīng)(增殖、分化、凋亡、應(yīng)激等)。研究表明，MAPK 通路在應(yīng)激條件下大大被激活，但在免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞生存分化方面也具有重要作用，使細(xì)胞能夠解析各種外部信號，并通過不同的生物效應(yīng)來適當(dāng)反饋[28]。erbB 蛋白屬于跨膜酪氨酸激酶的EGF 受體家族成員。在應(yīng)激狀態(tài)中，erbB 信號通路被激活并發(fā)生信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡等多重生物學(xué)作用。由此可見，MSC-EVs 中差異microRNAs 可能優(yōu)先調(diào)控上述關(guān)鍵通路，參與組織損傷的修復(fù)。

本研究篩選出的最重要的4 種microRNAs：hsa-miR-93-5p 調(diào)控193 個基因，參與42 個細(xì)胞通路；hsa-miR-19b-3p 調(diào)控142 個基因，參與51個細(xì)胞通路；hsa-miR-23b-3p 調(diào)控126 個基因，參與42 個細(xì)胞通路；hsa-miR-34a-5p 調(diào)控106 個基因，參與42 個細(xì)胞通路。RORA 和IQSEC2 是被microRNAs 調(diào)控最多的基因，均為7 個，CBL、DPYSL5 和VPS37D 均被6 個microRNAs 調(diào)控。細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)和誘導(dǎo)凋亡是被microRNAs 調(diào)控最多的功能。

miR-19 家族在心臟、血管、神經(jīng)元發(fā)育中起重要作用，可作為這些器官疾病的生物標(biāo)志物和干預(yù)的靶點(diǎn)[29]。有研究報道，MSC-EVs 中高表達(dá)miR-19b，可通過下調(diào)PTEN 的表達(dá)，起到抑制神經(jīng)元的凋亡、調(diào)控分化的作用[30]。另有研究報道，下調(diào)miR-34a-5p 可促進(jìn)脂肪MSC 的增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)脂肪MSC 對心肌梗死損傷的保護(hù)作用，而這一作用可能是通過刺激CTRP9 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[31]。miR-149-3p 通過靶向FTO 調(diào)節(jié)MSC 成脂分化和成骨分化的轉(zhuǎn)換[32]。暴發(fā)性心肌炎患者血漿miR-4763-3p 表達(dá)上調(diào)，且隨著病情的恢復(fù)，其表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)，提示miR-4763-3p 可作為暴發(fā)性心肌炎的生物標(biāo)志物。miR-4763-3p 的預(yù)測靶基因主要參與炎癥反應(yīng)過程，如T、B 細(xì)胞受體、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移以及趨化因子信號通路等[33]。這些研究結(jié)果支持上述microRNAs 可能參與調(diào)控缺氧預(yù)處理MSC 的組織修復(fù)過程。

綜上所述，本研究用微陣列方法篩選了缺氧預(yù)處理MSC-EVs 與其母細(xì)胞差異microRNAs 的表達(dá)譜，通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測了microRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提供了缺氧預(yù)處理MSC-EVs 組織修復(fù)的候選分子及其相關(guān)途徑列表，為后續(xù)機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。后續(xù)，我們將進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)的功能研究，以確認(rèn)這些候選分子和途徑的功能和作用。