不同低溫冷藏保存液對(duì)大鼠離體腹主動(dòng)脈血管功能及結(jié)構(gòu)的影響

任章勇，呂少誠，曹 迪，李立新，賀 強(qiáng)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 肝膽外科，北京 100020

隨著外科手術(shù)器械的改良以及手術(shù)技術(shù)的提高，血管重建技術(shù)在外科手術(shù)中的應(yīng)用越來越廣泛[1-4]。目前在血管重建中應(yīng)用的血管移植物有自體靜脈、人造血管及同種異體血管。同種異體血管具有來源豐富、管徑易匹配、組織相容性好、近遠(yuǎn)期通暢率高等優(yōu)點(diǎn)，目前其在臨床中的應(yīng)用逐漸增多[5-7]。深低溫冷凍保存是離體血管組織最常用的保存方式[7]，但由于需要昂貴的保存設(shè)備，以及煩瑣的降溫和復(fù)溫步驟，其在臨床中的應(yīng)用遭到一定程度的限制。因此低溫冷藏保存方案成為臨床醫(yī)療實(shí)踐中離體血管組織常用的短期保存方式[8]。有文獻(xiàn)表明將供體器官溫度從37℃降低至4℃，其新陳代謝可降低12 倍[9]。然而僅低溫并不能完全消除器官組織離體期間的細(xì)胞損傷，此外，體溫過低會(huì)導(dǎo)致Na+/K+ATPase 改變，ATP 耗竭，Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，線粒體擾動(dòng)，黃嘌呤氧化酶蓄積以及活性氧含量升高，這些變化均能對(duì)細(xì)胞生存活力產(chǎn)生有害影響[10-11]。因此需要合適的低溫保存液組成方案對(duì)離體組織細(xì)胞提供額外的保護(hù)。目前用于臨床的冷藏保存液有威斯康星大學(xué)保存液(University of Wisconsin solution，UW)、 組 氨 酸 色氨酸酮戊二酸酯(histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK)、0.9%氯化鈉注射液(normal saline，NS)及乳酸鈉林格氏液(Ringer's solution，RS)[12-15]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探索不同保存液對(duì)離體血管功能及結(jié)構(gòu)的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量為280 ～ 300 g 的清潔級(jí)雄性SD 大鼠。飼養(yǎng)環(huán)境：陰暗、安靜的環(huán)境，溫度18℃ ～ 26℃，相對(duì)濕度40% ～ 70%，通風(fēng)換氣8 ～12 次/h。

2 實(shí)驗(yàn)儀器 Powerlab 四道生理記錄儀(澳大利亞，AD Instruments 公司)；血管張力計(jì)算機(jī)軟件(LabChart Pro v7.3.8， 澳 大 利 亞，AD Instruments公司)；多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，美國，Thermo scientific 公司)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑 苯腎上腺素(Pheny lephrine，PE，上海禾豐制藥)；噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；UW 液(University of Wisconsin solution，百時(shí)美施貴寶( 中國) 投資 有 限 公 司)；HTK 液(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution，德國，F(xiàn)ranz Koehler Chemie GMBH)；199 培養(yǎng)基(美國，Sigma)；青霉素-鏈霉素雙抗液(penicillin-streptomycin，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；HEPES 液(NaCl 144 mmol/L，KCl 5.8 mmol/L，CaCl22.5mmol/L，MgCl21.2mmol/L，HEPES 5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH 7.4)。

4 血管獲取 選取280 ～ 300 g雄性SD大鼠，經(jīng)5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，獲取長約2 cm 腹主動(dòng)脈，經(jīng)冰0.9%氯化鈉注射液沖洗周圍血漬后于解剖顯微鏡下去除血管周圍脂肪及細(xì)小分支，最后剪切為約4 mm 的血管段。

5 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)分為UW 組、HTK 組、NS 組、RS 組及新鮮組；分別設(shè)置保存1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、30 d 及90 d 送檢；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置6 個(gè)樣本。

6 保存方法 UW 組：保存液組成(100 mL)：青霉素&鏈霉素雙抗液100 U、UW 液50 mL、Medium 199 培養(yǎng)液50 mL。取2 mL 上述保存液于2.5 mL凍存管，每個(gè)凍存管保存3 段血管，封口膜封口后置于4℃冰箱中保存。

HTK 組：UW 液更換為HTK 液，其余同UW 組。

NS 組：UW 液更換為NS 液，其余同UW 組。

RS 組：UW 液更換為RS 液，其余同UW 組。

新鮮組：于每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)獲取新鮮血管。

7 病原學(xué)檢測(cè) 各組血管標(biāo)本取出后用無菌研磨器研磨，將研磨液涂于血平皿和中國藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中，于35℃孵育箱中培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)菌生長情況。

8 組織病理檢測(cè) 各組標(biāo)本取出后，經(jīng)10%中性甲醛固定后切片，分別行HE 染色、Masson 染色及EVG 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察血管段內(nèi)膜、膠原纖維、彈性纖維等的變化情況。

9 血管細(xì)胞活性檢測(cè)—MTT 實(shí)驗(yàn) MTT 實(shí)驗(yàn)的原理為具有代謝活性的細(xì)胞可以將黃色的噻唑藍(lán)還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶，這種結(jié)晶的量與活細(xì)胞的量呈正相關(guān)[16-17]。獲取一段新鮮血管，失活處理作為空白對(duì)照。將各組血管分別加入MTT 液，于37℃的溫箱中孵育1 h，取出血管置于DMSO 中洗脫細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色結(jié)晶，多功能酶標(biāo)儀于570 nm 下讀取各組血管洗脫液的吸光值(Dx)及空白對(duì)照組吸光值(D0)；稱取各組血管段的重量(Mx)；結(jié)果以單位重量的吸光值表示：MTT(OD/m)=(Dx-D0)/Mx。

10 血管收縮功能檢測(cè)—張力實(shí)驗(yàn) 張力實(shí)驗(yàn)的原理為根據(jù)血管段對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)，評(píng)價(jià)血管段的收縮功能。于Powerlab 四道生理記錄儀的四個(gè)浴槽中各加入7 mL HEPES 液，將各組血管段套入浴槽中的張力探針上，將初始張力平衡在4 mN左右，每個(gè)浴槽加入7 μL 去甲腎上腺素，記錄加藥前后的張力變化(ΔF)。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS23.0 進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)，以表示。因組內(nèi)時(shí)間維度上的變化非本研究關(guān)注點(diǎn)，故不進(jìn)行重復(fù)測(cè)量分析，僅關(guān)注組間變化的主效應(yīng)分析，即多組間的比較僅做單因素方差分析(統(tǒng)計(jì)量為F)+兩兩比較LSD-t 檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量LSD-t)。統(tǒng)計(jì)推斷的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

結(jié) 果

1 不同組血管間一般資料的比較 由表1 ～ 表3 所示，各組保存的血管在長度、直徑及重量方面，組內(nèi)及組間樣本均數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2 不同組間血管病原學(xué)培養(yǎng)結(jié)果 從表4 可看出，保存1 個(gè)月內(nèi)，RS 組病原學(xué)培養(yǎng)陽性率為16.67%，其余各組均陰性；保存3 個(gè)月后，UW 組和RS 組陽性率為33.33%，HTK 組及NS 組陽性率為16.67%。

表4 不同保存組血管病原學(xué)培養(yǎng)陽性率(n，%；n=6)Tab. 4 Positive rate of vascular pathogen culture in different preservation groups (n, %; n=6)

3 不同組間血管組織病理結(jié)果 如圖1 ～ 圖3 所示，保存1 周內(nèi)，各保存組血管內(nèi)皮均破壞消失，但管壁各層結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維及彈性纖維均著色良好；保存1 個(gè)月后，各保存組血管管壁均有不同程度水腫，平滑肌細(xì)胞核數(shù)量少，膠原纖維及彈性纖維著色變淺，膠原纖維及彈性纖維可見不同程度分層、卷曲樣變；保存3 個(gè)月后，各組血管平滑肌細(xì)胞核基本溶解消失，管壁水腫、分層更為明顯，膠原纖維及彈性纖維著色進(jìn)一步變淺，NS 組及RS 組膠原纖維和彈性纖維甚至可見溶解斷裂現(xiàn)象。

表1 不同保存組血管長度的比較(mm，n=6)Tab. 1 Comparison of vessel length in different preservation groups (mm, n=6)

表2 不同保存組血管直徑的比較(mm，n=6)Tab. 2 Comparison of vessel diameter in different preservation groups (mm, n=6)

表3 不同保存組血管重量比較 (×10-3 g，n=6)Tab. 3 Comparison of blood vessel weight in different preservation groups (×10-3 g, n=6)

4 不同組間血管細(xì)胞活性結(jié)果 由表5 所示，隨著保存時(shí)間延長，各保存組血管MTT 值均逐漸降低，于各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與新鮮組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存3 d 內(nèi)，各保存組效果相當(dāng)，MTT 值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存5 ～ 7 d，UW組、HTK 組及NS 組保存效果相當(dāng)，MTT 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RS 組MTT 值低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存14 d，UW 組MTT 值最高，與其他三個(gè)保存組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RS組MTT 值最低，與其他三個(gè)保存組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存30 d，UW 組、HTK 組及NS 組MTT 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RS 組MTT 值低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存90 d，各個(gè)保存組MTT 值均有所升高，考慮細(xì)菌污染所致。

5 血管收縮功能結(jié)果 表6 所示，隨著保存時(shí)間延長，各保存組血管收縮性均逐漸降低，其ΔF值于各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與新鮮組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存1 d 后，各個(gè)保存組效果相當(dāng)，ΔF值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存3 d，NS 組ΔF 值最高，與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存5 d，RS 組ΔF 值最低，與其他三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存7 d，UW 組和HTK 組ΔF 值高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存14 d 后，RS 組失去收縮性，UW 組收縮性最高，HTK 組其次，ΔF 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；保存30 d 后，各個(gè)保存組血管均失去收縮性。

表5 不同保存組血管MTT 值(n=6)Tab. 5 MTT values of different preservation groups (n=6)

表6 不同保存組血管ΔF 值的比較(mN，n=6)Tab.6 Δ F values of different preservation groups (mN, n=6)

討 論

低溫保存的原理是通過降低組織細(xì)胞的溫度來降低細(xì)胞代謝，從而減緩細(xì)胞內(nèi)能量消耗及缺氧損傷。由于4℃的冷藏溫度并不能完全抑制細(xì)胞代謝，組織細(xì)胞缺氧損傷隨著時(shí)間的延長逐漸蓄積，因此研究各種低溫冷藏保存液對(duì)離體血管組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及血管功能的影響對(duì)臨床上低溫保存液的選擇具有積極作用。

0.9%氯化鈉注射液滲透壓與人體血液近似，鈉離子含量也與血漿相近，可維持組織細(xì)胞的正常形態(tài)。據(jù)報(bào)道目前約40%的中心選擇0.9%氯化鈉注射液作為自體靜脈的冷藏保存液[18-20]。作為一種簡單的等滲溶液，0.9%氯化鈉注射液并不是組織器官最理想的保存液，Tsakok 等[21]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.9%氯化鈉注射液對(duì)血管內(nèi)皮有害，且會(huì)損害平滑肌功能。林格氏液作為大多數(shù)外科病房的低成本生理溶液，臨床中可用于離體脾等器官組織的短期冷藏保存[13]。林格氏液與0.9%氯化鈉注射液相比，增加了乳酸根、鉀離子，可能會(huì)加重組織酸中毒而影響保存效果[22-23]。

大量臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明等滲液并不能避免低溫及缺氧對(duì)組織細(xì)胞造成的損傷，UW 液和HTK 液由此應(yīng)運(yùn)而生，二者均通過以下三個(gè)機(jī)制對(duì)離體組織細(xì)胞提供保護(hù)：1)膠體滲透保護(hù)作用。低溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜Na+/K+泵的調(diào)節(jié)功能異常或障礙，造成細(xì)胞內(nèi)Na+蓄積，水流入細(xì)胞內(nèi)而導(dǎo)致細(xì)胞水腫[24]。膠體等滲透保護(hù)劑的添加可增加細(xì)胞外滲透張力，通過將水滯留于細(xì)胞外室區(qū)而防治細(xì)胞水腫。UW 液和HTK 液分別以大分子棉子糖和甘露醇作為滲透保護(hù)劑[14]。2)緩沖系統(tǒng)。離體組織在缺血期間無氧代謝產(chǎn)生乳酸等成分可造成組織代謝性酸中毒，從而造成組織細(xì)胞損傷。UW 液和HTK 液中分別加入磷酸鹽及組氨酸作為緩沖系統(tǒng)，能有效緩解酸性成分對(duì)組織細(xì)胞造成的損傷[14]。3)抗氧化作用。離體組織細(xì)胞缺血缺氧期間會(huì)導(dǎo)致活性氧成分的增加，并可通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[25-27]，UW 液和HTK 液分別以谷胱甘肽、別嘌呤醇和色氨酸、α-酮戊二酸作為還原劑以減少活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷[28]。由于出色的保護(hù)性能，UW 液和HTK 液是近代實(shí)體器官移植中最常使用的兩種保存液。

本實(shí)驗(yàn)中，四種保存液在血管骨架保存方面均無明顯差異，在1 個(gè)月內(nèi)均能達(dá)到良好的保存效果。在血管收縮功能及細(xì)胞活性方面，林格氏液保存效果最差，保存3 d后效果即劣于其他三組；UW 液、HTK 液及0.9%氯化鈉注射液在7 d 內(nèi)的保存效果相當(dāng)，保存14 d 時(shí)UW 液的保存效果優(yōu)于其他幾組。UW 液及HTK 液在離體血管細(xì)胞活性及收縮功能保護(hù)方面均表現(xiàn)出色，考慮為膠體滲透劑及抗氧化劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)有關(guān)。但遺憾的是，四種保存液均未能有效地保存離體血管的內(nèi)皮，改進(jìn)保存液以保持離體血管的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。