亞硝酸鈉誘導的草魚肝細胞凋亡中內質網應激IRE1通路的作用研究

陳思琪 謝麗霞 姚朝瑞 李大鵬 湯 蓉

(華中農業大學水產學院, 池塘健康養殖湖北省工程實驗室, 農業部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

在生態系統中, 亞硝酸鹽是氮循環的一個天然組成部分, 現已成為水產養殖系統中一個潛在性問題[1]。在高密度集約化養殖系統中, 由于放養密度增大以及過度投餌造成的高蛋白殘餌和高含氮排泄物不斷沉積于池底, 超過養殖水體代謝能力, 硝化細菌的消化平衡遭到破壞, 進而導致亞硝酸鹽的積累,成為水產養殖過程中面臨的重要脅迫因子[2]。水體中亞硝酸鹽是由氨通過硝化細菌硝化作用形成的,其可以在水生系統中積累到很高的濃度[1]。已有研究表明, 養殖水體中高濃度亞硝酸鹽和氨氮是誘發魚病主要的環境因子[3], 亞硝態氮和氨氮引起的水質惡化受到了養殖界和相關學者的高度重視。

水體中亞硝酸鹽濃度升高會對水生動物產生多種生理干擾, 如生長抑制、組織損傷、內臟功能紊亂和內分泌紊亂等[4]。亞硝酸鹽暴露對魚、蝦和蟹等養殖對象均具有一定的毒性作用, 影響生長發育, 誘發組織病理變化, 降低抵抗力, 甚至導致死亡[5]。水體中的亞硝酸鹽通過鰓上皮細胞進入魚體, 主要將血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白, 從而導致血液載氧能力逐漸降低, 造成組織缺氧、神經麻痹、攝食量降低、鰓組織出現病變、呼吸困難、騷動不安或反應遲鈍, 嚴重時則使生物發生暴發性死亡[6,7]。此外, 水體中亞硝酸鹽濃度超過一定濃度會引起應激, 從而誘導動物細胞凋亡[8]。目前關于亞硝酸鹽對細胞凋亡的研究報道主要集中在個體水平研究,通過細胞水平揭示亞硝酸鹽引起細胞凋亡的研究相對較少, 其潛在的作用機制還有待闡明。細胞凋亡存在于機體的整個生命過程, 參與了各種生理及病理過程?，F已有研究發現內質網也參與細胞凋亡的途徑。內質網是蛋白質折疊和轉運的專用細胞器, 對細胞內穩態和細胞外刺激的變化高度敏感[9]。環境應激引起的未折疊、錯折疊、突變蛋白積累均可作為應激信號干擾內質網穩態并引起內質網應激(Endoplasmic reticulum stress, ER Stress)。為了應對這種環境應激, 機體內質網會作出未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR)的保護性或適應性策略, 以此恢復內質網的穩態[10], 如果內質網應激的不良作用過大, 細胞開始凋亡。UPR有三個通路： IRE1、PERK和ATF6。IRE1是一個內質網I型跨膜糖蛋白, 在胞內段具有激酶活性和RNA酶活性。在哺乳動物細胞中有 IRE1α和IRE1β 兩種亞型, IRE1α普遍存在于所有的組織細胞中, 而 IRE1β 主要存在于腸上皮細胞中[11]。內質網應激能導致IRE1腔內結構域與BiP解離, IRE1寡聚化, 自身磷酸化激活其RNA酶活性[12]。兩者的底物都是X-box 結合蛋白 1(XBP1) mRNA, 其編碼堿性含有亮氨酸鋅指結構的轉錄因子。IRE1的RNA酶活性切割 XBP1 mRNA, 使其成為成熟的 mRNA,其編碼的 XBP1 蛋白能增強分子伴侶蛋白 BiP 等的轉錄活性[13]。在持續性的內質網應激條件下曾觀察到IRE1信號通路關閉, 而PERK信號通路仍然發揮作用直至細胞死亡。因此有研究認為UPR的IRE1通路分支主要參與存活反應[14], 而近來研究更是表明IRE1通路是決定細胞生存或者凋亡的關鍵途徑[15]。

草魚(Ctenopharyngodon idella)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬。因其生長迅速, 飼料來源廣,是我國淡水集約化系統的主要物種之一, 目前正遭受著由氨氮和亞硝酸鹽等水污染引起的環境壓力。水產養殖中亞硝酸鹽含量的高低決定著養殖水質的好壞, 亞硝酸鹽含量高對養殖動物帶來很大的危害, 當前水產養殖集約化高密度養殖導致很多池塘亞硝酸鹽含量超標。肝臟作為魚類體內主要的解毒器官, 其在應對外界污染物脅迫中起到關鍵性作用, 同時也是亞硝酸鹽主要靶器官之一[16—18]。本實驗以草魚肝細胞系L8824為實驗對象, 進行亞硝酸鈉的急性暴露, 通過檢測細胞凋亡相關基因表達、細胞凋亡和細胞中內鈣離子濃度變化, 探討亞硝酸鈉暴露對草魚肝細胞的凋亡影響以及內質網應激通路中IRE1通路在其中發揮的作用, 以闡明亞硝酸鈉導致草魚肝細胞凋亡中可能的致毒機制, 以期為草魚的科學化養殖提供可靠的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚肝細胞系(L8824)購自中國典型培養物保藏中心; M199培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Trypsin-Ethylene diamine tetraacetic acid, Trypsin-EDTA)購自Gibco公司; CCK8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; Annexin-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所;STF-083010和2-APB購自美國APExBIO公司。

1.2 細胞培養

L8824培養于含10%胎牛血清的M199培養液中, 置于28℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中培養。細胞匯合達80%—90%時, 用0.25%胰蛋白酶消化,離心, 常規傳代。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

將處于對數生長期狀態良好的細胞以5×105/mL密度接種于96孔板, 每孔100 μL, 培養箱中預培養24h后分別換為不同濃度的亞硝酸鈉(0、5、20和50 mg/L) M199培養基分別孵育12h和24h, 每組4個平行, 在培養結束后, 每孔加入10 μL CCK8試劑, 孵育2.5h后用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度(A值); 用IRE1α抑制劑STF-083010 (50 μmol/L)[19]與20 mg/L NaNO2共同處理草魚肝細胞24h, 每組4個平行。在培養結束后, 每孔加入10 μL CCK8試劑, 孵育2.5h后用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度(A值)。

1.4 Annexin-FITC /PI 雙染流式細胞術檢測細胞凋亡

將細胞接種于六孔板中, 待細胞匯合達80%—90%時, 將培養基分別換為不同濃度的亞硝酸鈉(0、5、20 和50 mg/L) M199培養基分別孵育12h和24h, 用胰蛋白酶消化, 制成細胞懸液, 離心取細胞沉淀, 用PBS洗滌, 4℃ 300×g離心5min, 2次, 棄上清液, 將細胞重懸浮于100 μL Binding Buffer。加入5 μL Annexin-FITC和10 μL PI, 輕輕混勻, 避光室溫反應10min, 加入400 μL Binding Buffer, 1h內進行檢測; 將細胞接種于六孔板中, 待細胞匯合達80%—90%時, 用IRE1α抑制劑STF-083010(50 μmol/L)與20 mg/L亞硝酸鈉共同處理草魚肝細胞24h, 用胰蛋白酶消化, 制成細胞懸液, 離心取細胞沉淀, 用PBS洗滌, 4℃ 300×g離心5min, 2次, 棄上清液, 將細胞重懸浮于100 μL Binding Buffer。加入5 μL Annexin-FITC和10 μL PI, 輕輕混勻, 避光室溫反應10min, 加入400 μL Binding Buffer, 1h內進行檢測。每個處理組取200 μL加入培養皿中, 在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡。

1.5 反轉錄聚合酶反應(RT-RCR) 檢測mRNA表達量變化

取對數生長期L8824, 接種于6孔板。每孔2 mL培養液, 每組3個平行。按照上述處理方法, 對細胞進行處理, 培養完成后收集各組細胞。Trizol法提取細胞總RNA, 測定其濃度、純度并按試劑盒說明書步驟反轉錄cDNA。引物為擎科生物公司設計合成, 引物名稱序列擴增片段長度見表1。qPCR反應配置為蒸餾水7.2 μL, SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL, 上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL, 下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL, 樣品cDNA溶液2 μL, 總體積20 μL。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.6 熒光顯微鏡觀察細胞內鈣離子濃度變化

取生長狀態良好的對數生長期的L8824細胞接種于六孔板中, 接種濃度約為1×106個細胞/孔, 依照上述處理方法, 對細胞進行處理。在培養結束后,除去培養基。用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)溶液洗滌3次, 加入FLuo-4 AM工作液(5 μmol/L), 37℃培養箱孵育30min, 除去FLuo-4 AM工作液, 用HBSS溶液洗滌細胞3次, 加入HBSS溶液覆蓋細胞, 37℃培養箱孵育30min, 用熒光顯微鏡檢測。

1.7 數據分析

各處理組設置3個重復, 數據以“平均數±標準差”, 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析, 差異顯著表示為P＜0.05。

2 結果

2.1 亞硝酸鈉對L8824細胞活力的影響

在亞硝酸鈉暴露12h后, 在暴露濃度為5 mg/L時, 細胞活力下降并不顯著, 此后隨著暴露濃度的增加, 與對照相比, 細胞活力均顯著性下降, 亞硝酸鈉暴露24h后, 隨著暴露濃度的增加, 與對照相比,細胞活力均顯著性下降, 暴露濃度為50 mg/L時細胞活力下降最為顯著(表2)。

2.2 亞硝酸鈉誘導L8824細胞凋亡

在亞硝酸鈉暴露12h后,jnk、bax、caspase9、caspase3表達量在最高濃度50 mg/L時均顯著上升,bcl-2表達量顯著下降。亞硝酸鈉暴露24h后,jnk表達量在20 mg/L時顯著性升高,bax、caspase9、caspase3表達量在20和50 mg/L時均顯著性上升, 而bcl-2表達量在20 mg/L時顯著下降, 其中,bax表達量在20 mg/L時達到最大值, 而caspase9、caspase3表達量在50 mg/L時達到最大值。

由圖1可見, 亞硝酸鈉暴露濃度為20 mg/L時,隨著暴露時間的增加,jnk、caspase9、caspase3表達量均顯著上升, 而bcl-2表達量顯著下降。亞硝酸鈉暴露濃度為50 mg/L時, 隨著暴露時間的增加,bax、caspase9 和caspase3表達量均顯著性上升。

在亞硝酸鈉暴露12h和24h后, 與對照相比, 暴露濃度在5 mg/L時L8824 細胞凋亡率沒有顯著性變化, 在高濃度20和50 mg/L暴露時, L8824 細胞凋亡率均顯著性上升。在亞硝酸鈉暴露濃度為20和50 mg/L時, 隨著時間的增加, L8824細胞凋亡率均顯著性上升(圖2)。

2.3 亞硝酸鈉誘導草魚肝細胞L8824內質網應激

亞硝酸鈉暴露12h后,ire1α、xbp1s、grp78表達量在20和50 mg/L時均顯著性上升, 其中,ire1α表達量在50 mg/L時達到最大值, 而xbp1s、grp78表達量在20 mg/L時達到最大值。在亞硝酸鈉暴露24h后,ire1α、xbp1s和grp78表達量在5、20和50 mg/L時均顯著性上升, 其中ire1α和grp78表達量在50 mg/L時達到最大值, 而xbp1s表達量在20 mg/L時達到最大值(圖3)。

2.4 亞硝酸鈉誘導細胞內鈣離子紊亂

由圖4可見, 亞硝酸鈉暴露12h和24h后, 對照組無明顯綠色熒光, 亞硝酸鈉濃度從5到50 mg/L, 細胞內綠色熒光開始變多且趨于明亮, 鈣離子熒光強度相對于對照均顯著性上升。亞硝酸鈉暴露相同濃度時, 隨著時間的增加, 細胞內綠色熒光開始變多且趨于明亮, 鈣離子熒光強度相對于對照均顯著性上升, 呈現濃度與時間依賴性。

表2 不同濃度亞硝酸鈉對L8824 細胞活力的影響Tab. 2 The effect of sodium nitrite on the viability of L8824 cells

2.5 IRE1α抑制劑STF-083010通過抑制IRE1通路減少亞硝酸鈉誘導的細胞凋亡

在20 mg/L亞硝酸鈉暴露組中加入IRE1α抑制劑STF-083010 (50 μmol/L)作用24h, 與對照相比, STF-083010對L8824細胞活力沒有顯著性影響, 亞硝酸鈉單處理組細胞活力顯著下降。與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組細胞活力顯著上升(表3)。

圖1 亞硝酸鈉對L8824細胞jnk、bcl-2、bax、caspase9和caspase3表達量的影響Fig. 1 Effects of sodium nitrite on the expression of jnk, bcl-2,bax, caspase9 and caspase3 in L8824 cells

圖2 亞硝酸鈉對L8824細胞凋亡的影響Fig. 2 The effect of sodium nitrite on apoptosis of L8824 cells

由圖5可見, 與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉單處理組中ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase9和caspase3的表達顯著上升,bcl-2表達量顯著下降。與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組ire1α、jnk、bax和caspase3的表達顯著下降,bcl-2表達量顯著上升,caspase9表達量無顯著性變化。與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉處理組凋亡率顯著上升; 與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組細胞凋亡率顯著下降(圖6A)。在熒光顯微鏡下觀察, 與對照相比, 亞硝酸鈉處理組熒光強度顯著增強; 與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組熒光強度顯著降低(圖6B)。

2.6 2-APB和STF-083010減弱亞硝酸鈉誘導的細胞內鈣離子紊亂

與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉處理組綠色熒光變多且強度顯著增強, 與亞硝酸鈉單處理組相比,2-APB組和STF-083010組綠色熒光變少且強度顯著減弱(圖7)。

3 討論

3.1 亞硝酸鹽誘導L8824細胞發生凋亡

圖3 亞硝酸鈉對L8824細胞ire1α, xbp1s和grp78表達量的影響Fig. 3 Effects of sodium nitrite on the expression of ire1α, xbp1s and grp78 in L8824 cells

圖4 亞硝酸鈉對L8824細胞內鈣離子濃度的影響Fig. 4 The effect of sodium nitrite on the intracellular calcium content in L8824 cells

亞硝酸鹽作為氨轉化為硝酸鹽過程中的中間產物, 其對魚、蝦和蟹等水生生物均具有較強的毒性作用, 是養殖水域中誘發暴發性疾病的重要因素。關于亞硝酸鹽對魚類的致毒機理, 國內外已在多種魚類中開展了相關研究[20,21]。亞硝酸鹽進入水生動物的體內主要通過鰓的吸收作用, 在淡水魚和甲殼動物中, 其體液離子濃度相對于外界水環境處于高滲狀態, 因此必須通過鰓的主動吸收以彌補機體離子的流失[22]。亞硝酸鹽進入水生生物體內主要通過離子交換機制。在淡水魚類的鰓上皮上面存在一種Cl-/離子交換機制, 一般在碳酸酶(CA)作用下。H2CO3被水解為H+和, 而H+-ATPase主動運輸為排出胞外的濃度梯度。在Cl-/離子交換機制作用下,得以排出細胞膜外而環境中存在的Cl-被主動吸收進入鰓上皮細胞[23]。而當水生生物處于較高濃度的亞硝酸鹽暴露下, Cl-/離子交換機制受到影響, 一部分Cl-吸收能力被的吸收代替, 從而造成了水生生物體內亞硝酸鹽的堆積。亞硝酸鹽通過陰離子交換機制進入鰓上皮以后, 在細胞外液中往往能夠積累到很高的濃度[24]。而隨著亞硝酸鈉不斷進行積累, 其導致血液中高鐵血紅蛋白的毒性越發的明顯, 失去部分氧氣運輸的能力造成魚體最終窒息死亡[25]。此外, 亞硝酸鹽暴露往往能夠引起魚體的氧化應激, 因此魚類中抗氧化酶活性水平的變化往往作為不同水生生物應激反應的生物標志物[26]。在對羅非魚(Tilapia nilotica)的研究中發現,當水環境中的亞硝酸鹽濃度高于羅非魚自身的耐受范圍時, 其丙二醛的含量隨著氧自由基積累而增加[27]。而魚體內為了防止氧自由基的積累, 常常依賴于由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶類組成的抗氧化系統的作用, 而長期暴露可能會對抗氧化系統產生一定的抑制作用。魚類肝臟在調控基礎代謝、降解與排泄外源有毒物質中發揮重要作用, 并且可以作為魚體健康狀況的指示性參數, 肝臟作為亞硝酸鈉的主要解毒器官之一, 肝細胞可以將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽以達到解毒目的[28]。簡而言之, 亞硝酸鹽作為強氧化劑, 進入機體后會削弱其血紅細胞運氧能力,并引起自由基增多、生理紊亂、組織缺氧, 體內多種生理機能的障礙和下降, 產生氧化應激、擾亂內分泌、造成組織損傷、引起細胞凋亡, 從而影響正常的生理機能[29,30]。目前有關于亞硝酸鈉對肝臟細胞凋亡的研究還比較局限, 亞硝酸鈉誘導肝臟細胞凋亡可能存在的分子機制還有待闡明。本實驗結果發現亞硝酸鈉暴露下凋亡相關基因,jnk、bax、caspase9、caspase3表達量顯著性上升, 亞硝酸鈉暴露12h和24h后L8824細胞凋亡率顯著上升。以上結果表明, 急性亞硝酸鈉暴露能導致草魚肝細胞凋亡。Al-Gayyar 等[31]在研究黑藻油對亞硝酸鈉引起的大鼠細胞凋亡的影響中發現亞硝酸鈉引起大鼠腎組織損傷, 并引起了大鼠腎組織發生細胞凋亡;Al-Rasheed 等[32]研究槲皮素對亞硝酸鈉所致缺氧大鼠肝、肺、腎、心肌組織的保護作用中, 發現亞硝酸鈉會下調大鼠組織中bcl-2表達量, 誘導發生細胞凋亡, 與本實驗結果相一致。

表3 亞硝酸鈉和STF-083010共同作用對L8824細胞活力的影響Tab. 3 Effects of sodium nitrite and STF-083010 on the viability of L8824 cells

圖5 亞硝酸鈉和STF-083010及其配伍對L8824細胞ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bcl-2、bax、caspase9和caspase3表達量的影響Fig. 5 Effects of sodium nitrite, STF-083010 and their combination on the expression of ire1α, xbp1s, grp78, jnk, bcl-2, bax, caspase9 and caspase3 in L8824 cells

3.2 亞硝酸鹽誘導L8824細胞發生內質網應激

圖6 亞硝酸鈉和STF-083010及其配伍對L8824細胞凋亡的影響Fig. 6 Effects of sodium nitrite, STF-083010 and their combination on the cell apoptosis of L8824 cells

UPR是由一個內質網分子伴侶GRP78和3個內質網應激感受蛋白所介導的, 分別是PERK (PKR-like ER kinase)、ATF6 (Activating transcription factor 6)和IRE1。IRE1被認為是UPR信號中最后一個被激活的分子, IRE1一旦被激活, 首先通過剪接XBP1誘導UPR, 隨后誘導P58IPK的表達恢復蛋白質合成, 使細胞恢復到正常狀態。但如果應激繼續加重, IRE1 就會通過激活JNK激酶, 削弱Bcl-2的抗凋亡功能, 從而誘導內質網膜上Bax和Bak構象變化并寡聚化最終導致內質網膜完整性的破壞和細胞內鈣離子濃度增加, 激活Caspase9 最終激活Caspase3 誘導細胞凋亡[33]。在本實驗中ire1α和grp78表達量在高濃度亞硝酸鈉暴露12h和24h后顯著性上升, 但xbp1s在亞硝酸鈉暴露24h后表達量顯著下降, 這表明隨著暴露時間的增加, UPR中IRE1-XBP1通路被抑制, 原因可能是因為隨著暴露時間的增加,IRE1減少對XBP1的剪接作用, 內質網應激減弱,IRE1激活JNK, 誘導細胞凋亡。Dickhout 等[34]通過檢測到GRP78和GPR94的蛋白表達量上調發現過氧化亞硝酸鹽在人血管內皮引起了內質網應激。同時, 熒光顯微鏡檢測細胞內鈣離子濃度發現, 不同濃度和不同時間的亞硝酸鈉暴露都引起了不同程度的鈣離子紊亂, 內質網分子伴侶在內質網應激中發揮作用需要鈣離子的參與, 因此鈣離子紊亂會誘導發生內質網應激[35]。而在本實驗中內質網分子伴侶grp78 mRNA 表達量在亞硝酸鈉暴露后顯著上升支持了這個結論, GRP78是鈣離子的緩沖伴侶, 能夠影響內質網依賴的鈣離子穩態[36,37], 亞硝酸鈉通過引起內質網釋放鈣離子誘導細胞內鈣離子水平升高, 阻礙了內質網折疊蛋白的功能, 從而誘導細胞發生內質網應激[38]。以上結果表明, 亞硝酸鈉能夠通過激活IRE1通路引起草魚L8824細胞發生內質網應激。

圖7 2-APB和STF-083010 對亞硝酸鈉暴露L8824細胞內鈣離子濃度的影響Fig. 7 Effects of 2-APB and STF-083010 on the intracellular calcium content under sodium nitrite exposure in L8824 cells

3.3 IREI通路在亞硝酸鹽誘導L8824細胞發生凋亡中發揮重要作用

近年來大量研究表明內質網應激是誘導細胞凋亡的重要途徑[39], 為研究IRE1 通路在亞硝酸鈉誘導L8824細胞發生凋亡的作用, 本實驗用IRE1α抑制劑STF-083010與20 mg/L亞硝酸鈉共同作用于L8824細胞24h, 結果發現, 在IRE1被抑制后, 細胞凋亡率顯著下降,jnk、bax、caspase3表達量也顯著下降, 而抗凋亡分子bcl-2表達量顯著上升, 說明JNK誘導的細胞凋亡也被抑制。同樣地, Kato 等[40]發現在深部組織損傷的大鼠腎小管上皮細胞中, 抑制IRE1通路可顯著降低細胞凋亡; Huang 等[41]研究發現乙型腦炎病毒誘導BHK-21細胞凋亡實驗中, 抑制IRE1通路也可顯著降低BHK-21細胞凋亡。此外, 在本實驗中熒光顯微鏡檢測細胞內鈣離子濃度結果顯示, 加入STF-083010顯著減弱了鈣離子紊亂, 減少了內質網應激[38]。由此可見, 亞硝酸鹽和其他的致凋亡因子相似, 可以通過抑制IRE1通路降低其誘導的細胞凋亡。

綜上所述, 高濃度亞硝酸鈉會誘導L8824細胞發生凋亡, 激活內質網應激IRE1通路, 顯著降低細胞活力, 并引起細胞質內鈣離子紊亂; 加入了IRE1抑制劑后, 細胞凋亡和細胞質內鈣離子濃度顯著降低, 細胞活力顯著升高。以上結果表明, 內質網應激IRE1通路在高濃度亞硝酸鈉誘導的L8824細胞凋亡中發揮了重要作用。