西藏溫泉兩種中國(guó)新記錄纖毛蟲(chóng)第一雙小核草履蟲(chóng)和明布雷斯四膜蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究

姜傳奇 谷思雨 安瑞志 巴 桑* 繆 煒*

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 哈爾濱師范大學(xué)黑龍江省水生生物多樣性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150025; 3. 西藏大學(xué)理學(xué)院濕地與流域生態(tài)實(shí)驗(yàn)室, 拉薩 850000)

纖毛蟲(chóng)隸屬原生生物界, 原生動(dòng)物亞界, 是較復(fù)雜的單細(xì)胞真核生物。纖毛蟲(chóng)物種豐富, 已記載8000余種, 廣泛分布于淡水、海水、土壤甚至一些極端環(huán)境中[1]。青藏高原是“世界屋脊”, 有著獨(dú)特的自然環(huán)境和豐富的生物資源。其中, 西藏地區(qū)地?zé)豳Y源非常豐富, 各種地?zé)犸@示遍布全區(qū)。1966年和1973—1976年, 王家楫等在第一次青藏高原綜合科學(xué)考察中采集了大量的無(wú)脊椎動(dòng)物標(biāo)本, 隨后完成的《西藏高原部分地區(qū)的原生動(dòng)物》、《珠穆朗瑪峰地區(qū)的原生動(dòng)物》、《西藏水生無(wú)脊椎動(dòng)物》共記述了西藏地區(qū)原生動(dòng)物458種, 其中纖毛蟲(chóng)288種[2—4]。期間, 也對(duì)部分溫泉的原生動(dòng)物進(jìn)行調(diào)查, 共鑒定到原生動(dòng)物52種, 其中纖毛蟲(chóng)有13種[4]。近年來(lái), 隨著纖毛蟲(chóng)培養(yǎng)技術(shù)和研究手段的逐步發(fā)展完善, 可以對(duì)西藏溫泉生境該類(lèi)群的生物資源開(kāi)展更深入和系統(tǒng)的研究。

本研究對(duì)位于西藏地區(qū)的日多溫泉和羊八井溫泉進(jìn)行樣品采集, 鑒定得到了兩種寡膜綱纖毛蟲(chóng)中國(guó)新記錄種： 咽膜類(lèi)的第一雙小核草履蟲(chóng)(Para-mecium primaurelia)和膜口類(lèi)的明布雷斯四膜蟲(chóng)(Tetrahymena mimbres)。本研究詳細(xì)描述了這兩種纖毛蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征, 測(cè)定了它們的SSU rDNA和COXⅠ基因序列并基于這兩種分子標(biāo)記進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

兩種纖毛蟲(chóng)第一雙小核草履蟲(chóng)和明布雷斯四膜蟲(chóng)于2018年10月采自西藏高原, 其中P. primaurelia采自拉薩市墨竹工卡縣的日多溫泉(N 29°41′,E 92°14′; 海拔： 4365 m; 水溫： 50—60℃),T. mimbres采自當(dāng)雄縣的羊八井溫泉(N 29°58′, E 90°21′; 海拔：4350 m; 水溫： 43℃)。使用采樣瓶收集溫泉原位水及懸浮物。樣品采集后, 在實(shí)驗(yàn)室將不同采集地點(diǎn)的水樣搖勻分別倒入培養(yǎng)皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿加入兩粒已滅菌的麥粒, 將培養(yǎng)皿蓋好蓋子分別放入封閉樣品盒內(nèi)以避免樣品交叉污染。培養(yǎng)4—5d后, 在解剖鏡(ZEISS Stemi2000-C)下, 利用微吸管分離單克隆株系, 并使用過(guò)濾(濾膜規(guī)格： 0.22 μm)原位水加入滅菌麥粒于25℃擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)學(xué)研究

在解剖鏡下利用微吸管挑取少量纖毛蟲(chóng)于載玻片上進(jìn)行活體壓片, 在顯微鏡下(100×—1000×)觀察蟲(chóng)體的大小、顏色、形狀、運(yùn)動(dòng)方式和伸縮泡等活體特征。采用蛋白銀染色法[5]和氨銀染色法[6]制片, 分別獲得P. primaurelia和T. mimbres的纖毛圖式和核器特征等。此外, 細(xì)胞核的形態(tài)還以2%多聚甲醛(PFA)固定細(xì)胞, 經(jīng)0.5 μg/mL DAPI(4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚)核酸染料染色,在熒光顯微鏡下觀察。顯微觀察及拍照利用尼康顯微鏡(Nikon EC-LIPSE 80i)。系統(tǒng)分類(lèi)和術(shù)語(yǔ)依據(jù)Lynn(2008)。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

第一雙小核草履蟲(chóng)(P. primaurelia)和明布雷斯四膜蟲(chóng)(T. mimbres)的DNA提取利用REDExtract-NAmpTMPCR試劑盒, 利用微吸管分別挑取少量的T. mimbres和P. primaurelia細(xì)胞, 經(jīng)蒸餾水清洗數(shù)次后, 放入PCR管中, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作, 釋放總DNA(www.sigmaaldrich.com)。兩種纖毛蟲(chóng)SSU rDNA序列的擴(kuò)增利用真核生物通用引物18S-F： 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′和18S-R： 5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′[7];P.primaurelia COXⅠ基因的擴(kuò)增利用引物F199dT-B：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTTCAGGWGCT GCMTTAGCHACYATG-3′和R1143dT： 5′-CAG GAAACAGCTATGACTARTATAGGATCMCCW CCATAAGC-3′;T. mimbresCOXⅠ基因的擴(kuò)增利用引物F298dT： 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT GCNCAYGGTYTAATNATGGT-3′和R1184dT： 5′-CAGGAAACAGCTATGACTADACYTCAGG GTGACCRAAAAATCA-3′[8]。PCR后, 擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測(cè)序公司測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

除新測(cè)序列外, 其余序列均來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 包括109條SSU rDNA基因序列和112條COXⅠ基因序列(序列信息詳見(jiàn)圖版Ⅰ、圖版Ⅱ)。選擇七種盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)(Pseudocohnilembus persalinus、Pseudocohnilembus longisetus、Philasterides dicentrarchi、Miamiensis avidus、Cyclidium glaucoma、Entodiscus borealis、Plagiopyliella pacifica)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。序列比對(duì)利用MEGA 6.0中的Muscle程序[9], 比對(duì)完成后, 兩端截平并手動(dòng)刪除無(wú)法明確比對(duì)的模糊區(qū)域。最大似然樹(shù)(ML)的構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件, 選擇GTR+I+G最優(yōu)模型, 節(jié)點(diǎn)置信值來(lái)自1000疊代重復(fù)抽樣[9]。貝葉斯樹(shù)(BI)利用MrBays 3.2.1軟件構(gòu)建, 選擇GTR+I+G最優(yōu)模型[10], MCMC模擬運(yùn)行10000000代, 每100代取樣1次, 前10000棵樹(shù)舍棄, 剩余的樹(shù)用來(lái)計(jì)算后驗(yàn)概率。使用MEGA 6.0軟件調(diào)整樹(shù)形[9]。

2 結(jié)果

2.1 第一雙小核草履蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)描述(圖版 Ⅰ, 表1)

活體約(150—200) μm × (60—100) μm, 腹面觀為長(zhǎng)橢圓形或足形, 前端略尖, 具有明顯的斜截區(qū),后端口區(qū)以下逐漸變窄, 蟲(chóng)體不對(duì)稱(chēng)(圖版 Ⅰ-A、E—I)?？趨^(qū)位于蟲(chóng)體腹面中部(圖版 Ⅰ-A、F、G、N)。蟲(chóng)體淺灰色, 體內(nèi)充滿內(nèi)含物, 包括食物顆粒、晶體和食物泡等(圖版 Ⅰ-A、E—I)。大核一個(gè), 橢圓形, 位于蟲(chóng)體中部, 約40 μm; 小核兩枚,靠近大核, 約2 μm (圖版 Ⅰ-A、R)。伸縮泡兩個(gè),分別于蟲(chóng)體前端和后端(圖版 Ⅰ-A、H)。體纖毛整齊, 長(zhǎng)約6 μm; 約十根尾纖毛聚集呈簇, 位于蟲(chóng)體尾部, 長(zhǎng)約15 μm (圖版 Ⅰ-I)。運(yùn)動(dòng)方式為沿身體長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)前進(jìn), 不時(shí)在水中快速自由穿梭。

表1 第一雙小核草履蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab. 1 Morphometric data of Paramecium primaurelia

體動(dòng)基列60—80列(圖版 Ⅰ-B, C, J, K), 口前和口后縫合線明顯, 口前縫合線從蟲(chóng)體頂端延至體中部胞口處, 口后縫合線從口區(qū)底端延伸至尾部(圖版 Ⅰ-B、K—M)?？谄骶哂袑俚湫吞卣鳎?由三片小膜(P1、P2、P3)和一片口側(cè)膜(PM)組成。三片小膜均由四列毛基列組成, P1四列毛基粒分散, P1長(zhǎng)于P2, P3最短(圖版 Ⅰ-D、O—Q)。

2.2 明布雷斯四膜蟲(chóng)(Tetrahymena mimbres)的形態(tài)學(xué)描述(圖版 Ⅱ, 表2)

活體約(35—50) μm × (15—25) μm, 呈卵圓形,前端稍尖, 后端鈍圓(圖版 Ⅱ-A、E—H), 長(zhǎng)寬比約2﹕1?？趨^(qū)較小, 位于體前端1/4處, 約占體長(zhǎng)的1/5—1/6?？诶w毛長(zhǎng)6—7 μm; 體纖毛密集排列, 長(zhǎng)4—5 μm (圖版 Ⅱ-A、F—H)。細(xì)胞質(zhì)無(wú)色至灰白色, 含有數(shù)個(gè)隨機(jī)分布的充滿細(xì)菌的食物泡(直徑約3 μm, 圖版 Ⅱ-A、E—H)。大核一個(gè), 球形或卵圓形, 直徑約10 μm, 位于體中部, 無(wú)小核(圖版 Ⅱ-I)。伸縮泡一個(gè), 位于體后部, 直徑約6 μm, 伸縮周期約1min (圖版Ⅱ-A、H)。

體動(dòng)基列16—18列, 縱向排列, 靠近蟲(chóng)體頂部毛基粒密集, 蟲(chóng)體后部較稀疏(圖版 Ⅱ-B、C、J—N)。口區(qū)前有明顯縫合線, 由口區(qū)前端延伸至蟲(chóng)體頂端無(wú)毛區(qū)(圖版 Ⅱ-B、J、M)。口后動(dòng)基列(PK)兩列, 口后動(dòng)基列1 (PK1)開(kāi)始于口側(cè)膜中間位置, 向后延伸至細(xì)胞末端; 口后動(dòng)基列2(PK2)開(kāi)始于口側(cè)膜底部, 延伸至蟲(chóng)體末端(圖版 Ⅱ-B、J)。口腔縱軸與體軸平行, 口區(qū)內(nèi)為典型的“四膜”式構(gòu)造, 包括三片口區(qū)小膜(M1、M2、M3)及一片口側(cè)膜(PM)。M1略長(zhǎng)于M2, M1與M2近乎平行, 均由三列平行的毛基粒構(gòu)成; M3較短, 形狀近似圓形。口側(cè)膜起始于M2前端, 圍繞三片小膜邊緣至口區(qū)底部(圖版 Ⅱ-D、O)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

本研究?jī)煞N纖毛蟲(chóng)的SSU rDNA和COXⅠ基因序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 其中P. primaurelia的SSU rDNA序列(序列號(hào)： MK579298, 長(zhǎng)度1649個(gè)堿基, GC含量43%)與GenBank中該種的序列(MG573196和MG573195)的相似度為100%、99%;其COXⅠ基因序列(序列號(hào)： MK715448, 長(zhǎng)度859個(gè)堿基, GC含量41%)與GenBank中該種的序列(FN421324和FJ905141)相似度均為99%。T.mimbres的SSU rDNA序列(序列號(hào)： MK579316, 長(zhǎng)度1655個(gè)堿基, GC含量43%)與GenBank中該種(EF070251)的相似度為99%; 其COXⅠ基因序列(序列號(hào)： MK715449, 長(zhǎng)度876個(gè)堿基, GC含量27%)與GenBank該種的序列(EF070292)的相似度為99%。

本研究選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中有SSU rDNA序列信息的38種四膜蟲(chóng)(46條序列)、20種草履蟲(chóng)(56條序列), 以寡膜綱七種盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)作為外類(lèi)群構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。結(jié)果顯示： (1)草履蟲(chóng)科單系。(2)新測(cè)序的西藏溫泉種P. primaurelia與來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的四個(gè)P. primaurelia種群(MG573194、MG573195、MG573196和AF100 315)聚為一枝, 聚在Paramecium aurelia復(fù)合種(P.aureliacomplex)內(nèi)。(3)四膜蟲(chóng)科單系, 包括兩個(gè)主要類(lèi)群：T. borealis類(lèi)群(T. borealisgroup)和T. australis類(lèi)群(T. australisgroup); (4)新測(cè)序的西藏溫泉種T. mimbres與GenBank的T. mimbres(EF070251)聚為一枝, 與T. elliotti(EF070246)聚為姐妹枝, 聚在T. borealis類(lèi)群中。

COXⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中四膜蟲(chóng)的57條和草履蟲(chóng)的48條序列, 以盾纖類(lèi)纖毛蟲(chóng)為外類(lèi)群構(gòu)建(圖2)。結(jié)果顯示： (1)本研究新測(cè)序的P. primaurelia與GenBank中11種P. primaurelia種群均聚為一枝, 聚在P. aurelia復(fù)合種(P. aureliacomplex)中。(2)本次新測(cè)序的T. mimbres與Gen-Bank中T. mimbres(EF070292)聚為一枝, 與T.elliotti(EF079281)聚為姐妹枝, 共同聚在T. borealis類(lèi)群中。

表2 明布雷斯四膜蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)Tab. 2 Morphometric data of Tetrahymena mimbres

圖1 基于核糖體小亞基基因序列構(gòu)建的最大似然樹(shù)Fig. 1 Maximum likelihood (ML) tree based on small subunit ribosomal DNA sequences

圖2 基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因序列構(gòu)建的最大似然樹(shù)Fig. 2 Maximum likelihood (ML) tree based on cytochrome oxidase subunit Ⅰgene sequences

3 討論

第一雙小核草履蟲(chóng)(Paramecium primaurelia)由Sonneborn于1975年命名, 屬于P. aurelia復(fù)合種[11]。Gill和Hanson(1968)、Hufnagel(1969)和Sonneborn(1975)對(duì)P. aurelia復(fù)合種進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究,P.primaurelia西藏種群符合P. aurelia復(fù)合種的形態(tài)學(xué)特征(蟲(chóng)體雪茄狀, 體長(zhǎng)80—200 μm, 是體寬的3—4倍; 伸縮泡兩枚; 大核一枚、小核兩枚; 體動(dòng)基列60—80列、口區(qū)結(jié)構(gòu)、前后縫合線等)[11—13]。本研究利用活體觀察、蛋白銀、DAPI染色法, 補(bǔ)充了該種活體特征、細(xì)胞核的形態(tài)和位置、纖毛圖式和口區(qū)三片咽膜及口側(cè)膜的排布模式, 并提供了該種西藏溫泉種群的SSU rDNA基因和COXⅠ基因序列信息。這兩種分子標(biāo)記基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析均支持P. primaurelia與GenBank中已發(fā)表的P.primaurelia種群聚為一枝, 聚在P. aurelia復(fù)合種中,與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致。

明布雷斯四膜蟲(chóng)(Tetrahymena mimbres)最早將其認(rèn)定為T(mén)etrahymena pyriformis復(fù)合種中的NT-1株系[14], 于1987年由Meyer和Nanney將其更名為T(mén).mimbres[15]。目前, 關(guān)于該種的研究較少, 無(wú)形態(tài)學(xué)方面的研究。本研究對(duì)該種活體形態(tài)、細(xì)胞核的形態(tài)和位置、體纖毛圖式和三片口區(qū)小膜及口側(cè)膜的排布模式進(jìn)行了詳細(xì)的描述, 并提供了該種西藏溫泉種群的SSU rDNA和COXⅠ基因序列信息,系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析支持該種聚在T. borealis種群內(nèi)部,與T. elliotti的親緣關(guān)系較近。

利用采樣瓶收集西藏溫泉原位水及懸浮物, 置于實(shí)驗(yàn)室中封閉培養(yǎng), 并在解剖鏡下利用微吸管分離單克隆株系, 進(jìn)一步培養(yǎng)獲得了兩種中國(guó)新記錄纖毛蟲(chóng)。其中,P. primaurelia為廣布種, 在美洲的南部、北部、中部, 歐洲的俄羅斯、馬爾他、保加利亞, 非洲的納塔爾, 亞洲的日本、緬甸等地均有報(bào)道[16—20], 顯示出其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性; 首次在西藏日多溫泉中的發(fā)現(xiàn), 表明該種還具有較強(qiáng)的高原和高溫適應(yīng)性。T. mimbres的首次發(fā)現(xiàn)是在美國(guó)新墨西哥州的溫泉(Mimbres hot springs)[21], 之后在美國(guó)德克薩斯州的溫泉中也有報(bào)道[22], 表明該種為喜高溫種類(lèi), 具有明顯的高溫適應(yīng)性。T. mimbres首次在西藏羊八井溫泉中的發(fā)現(xiàn), 也體現(xiàn)出該種有較強(qiáng)的高原適應(yīng)性。本研究借助纖毛蟲(chóng)培養(yǎng)技術(shù)和形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)研究手段, 鑒定出西藏溫泉的兩種中國(guó)新記錄纖毛蟲(chóng), 為西藏溫泉原生動(dòng)物生物資源的發(fā)掘提供新的方法和思路, 也為原生動(dòng)物環(huán)境適應(yīng)性研究提供基礎(chǔ)性資料。

圖版Ⅰ 第一雙小核草履蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征PlateⅠ Morphology of Paramecium primaurelia

圖版Ⅱ 明布雷斯四膜蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征PlateⅡ Morphology of Tetrahymena mimbres