珠江浮游真核微型生物分子多樣性及其與水環(huán)境的關(guān)系

朱昶宇 陸凱暉 伊珍珍

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

珠江水資源總量豐富, 在全國(guó)七大江河中排名第二, 僅次于長(zhǎng)江[1]。然而伴隨著珠三角地區(qū)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、城市規(guī)模不斷擴(kuò)大, 各種工業(yè)和生活污水、有機(jī)污染物不斷遷移入珠江水域, 珠江下游水污染問(wèn)題嚴(yán)重[2]。珠江主要支流西江和北江在流經(jīng)廣東省后污染狀況同樣不容樂(lè)觀, 西江水質(zhì)總體較差, 支流賀江水體整體處于中營(yíng)養(yǎng)水平, 發(fā)生藻類水華的潛在風(fēng)險(xiǎn)較高[3]。珠江廣州段和西江廣東段承載著珠三角地區(qū)重要的城市供水任務(wù), 與人民生活質(zhì)量以及當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展息息相關(guān), 日趨嚴(yán)重的水污染所導(dǎo)致的水質(zhì)性缺水, 已成為制約城市可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素[4]。此外, 珠江流域處于熱帶-亞熱帶地區(qū), 豐水期(4—9月)徑流量大, 占全年徑流總量的80%, 而枯水期(10月至翌年3月)的水量較少,僅占全年徑流總量的24%[5], 這意味著對(duì)珠江水質(zhì)狀況的研究有必要考慮豐水期及枯水期之間的差異, 但目前相關(guān)研究較少[6,7]。

真核微型生物在水生生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在, 主要包括原生動(dòng)物、真核微藻、真菌及線蟲等小型動(dòng)物[8], 由于生命周期短、敏感性強(qiáng)等特點(diǎn), 能迅速反映水環(huán)境變化[9,10]。例如, 浮游藻類群落分布與溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽變化顯著相關(guān)[11], 某些原生動(dòng)物類群豐度與氨氮濃度呈顯著正相關(guān)[12]。徐潤(rùn)林等[6]對(duì)珠江廣州市段的原生動(dòng)物群落組成和群集過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn), 原生動(dòng)物群落特征的變化與水質(zhì)變化相吻合, 珠江在流經(jīng)廣州市區(qū)后水質(zhì)發(fā)生了明顯地惡化。20世紀(jì)90年代, 沈韞芬等[13]便建立了適用于我國(guó)淡水生態(tài)環(huán)境的原生生物(真核微型生物)群落監(jiān)測(cè)方法, 并成為我國(guó)第一個(gè)淡水生物監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái), 徐奎棟等[14]將其改良并應(yīng)用到海水環(huán)境監(jiān)測(cè)中, 取得了較好的效果。

由于個(gè)體微小(通常為幾十至幾百微米), 基于形態(tài)鑒定基礎(chǔ)的真核微型生物群落研究, 高度依賴于研究人員的鑒定經(jīng)驗(yàn), 在一定程度上限制了原生動(dòng)物多樣性研究及其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的廣泛應(yīng)用。這也是珠江水體真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系研究較少的重要原因之一[3,6,15]。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism analysis, T-RFLP)可以定性和定量的進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析及不同群落結(jié)構(gòu)間的比較[16]。目前, T-RFLP被廣泛應(yīng)用于水體微生物多樣性及其與水環(huán)境關(guān)系的研究中, 例如： 環(huán)境因素對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能的影響[17],河流生態(tài)系統(tǒng)的健康評(píng)價(jià)[18], 指示生物的篩選[19]。

本文通過(guò)T-RFLP研究了珠三角地區(qū)珠江豐水期及枯水期浮游真核微型生物多樣性, 對(duì)比分析了不同時(shí)期、不同區(qū)域真核微型生物的群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系, 并篩選了潛在的敏感種和耐污種。以期較為全面地了解珠三角地區(qū)珠江水體中真核微型生物的動(dòng)態(tài)變化, 為后續(xù)珠三角地區(qū)珠江水質(zhì)監(jiān)測(cè)提供可靠的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

采樣點(diǎn)分為珠江廣州段(G)和西江廣東段(X),分別在其豐水期(2016年6月—2016年9月)和枯水期(2016年10月—2017年1月)采集水樣, 使用有機(jī)玻璃采水器采集表層水(30 cm—1 m)。其中, 豐水期設(shè)置了40個(gè)樣點(diǎn)(西江廣東段21個(gè), 珠江廣州段19個(gè)),枯水期設(shè)置了43個(gè)樣點(diǎn)(西江廣東段21個(gè), 珠江廣州段22個(gè), 圖1)。

1.2 水質(zhì)分析

現(xiàn)場(chǎng)使用便攜式多參數(shù)測(cè)量?jī)x(ORION 520M-01A)測(cè)定采樣位點(diǎn)的水溫(Temperature, Temp)、pH、溶解氧(Dissolved oxygen, DO)和鹽度(Salinity)。其余理化指標(biāo)參照《Water Analysis Handbook》(美國(guó)哈希公司)于實(shí)驗(yàn)室測(cè)定, 總氮(Total nitrogen, TN)的測(cè)定采用過(guò)硫酸鹽氧化法(0.5—25.0 mg/L); 氨氮(Ammonia nitrogen, AN)的測(cè)定采用USEPA納氏試劑法(0.02—2.5 mg/L)或水楊酸法(0.4—50 mg/L); 總磷(Total phosphorus, TP)的測(cè)定采用USEPA PhosVer 3抗壞血酸法(0.06—3.5 mg/L);化學(xué)需氧量(Chemical oxygen demand, CODCr)的測(cè)定采用USEPA消解比色法(3—150 mg/L); 高錳酸鹽指數(shù)(Permanganate index, CODMn)的測(cè)定采用高錳酸鹽法(0.5—5.0 mg/L)。

圖1 采樣點(diǎn)分布Fig. 1 Locations of sampling sites

1.3 生物富集與DNA提取

將200 mL水體抽濾到0.8 μm濾膜(美國(guó)頗爾公司)上, 用滅菌鑷子將濾膜取下, 在超凈工作臺(tái)上用滅菌剪刀將濾膜剪碎, 使用PowerSoil DNA Isolation Kit (美國(guó)Mobio)進(jìn)行環(huán)境總DNA提取。

1.4 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)

利用引物TAReuk454FWD1 (5′-CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC-3′), TAReukREV3(5′-ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A-3′)[20]擴(kuò)增真核微型生物18S rDNA的V4區(qū)。PCR體系為： 5 ×FastPfu Buffer, 2.5 mmol/L dNTPs, 1U FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司), 引物各5 μmol/L, 約10 ng基因組DNA, 反應(yīng)體系總量為20 μL。PCR反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 共27個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10min, 終止于4℃。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增效果, 并采用超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒DP203-02(北京天根生化科技有限公司)純化。

預(yù)實(shí)驗(yàn)選用了ApaⅠ、BamH Ⅰ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、HinfⅠ、HaeⅢ等限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理, 根據(jù)酶切效率、區(qū)分能力等因素, 最終選取HaeⅢ構(gòu)建酶切體系： 10 μL回收產(chǎn)物, 2 μL QC緩沖液, 0.4 μLHaeⅢ酶(日本TaKaRa公司)和7.6 μL滅菌雙蒸水。放置水浴鍋中37℃溫浴1h,1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)酶切效果。最后將剩余酶切產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳并檢測(cè)熒光和熒光強(qiáng)度(上海生工生物工程有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)取整, 保留50—500 bp內(nèi)的末端限制性片段數(shù)據(jù)(T-RFs), 看作是物種種類數(shù)。計(jì)算同一樣品的所有峰度面積之和, 以及各片段面積占所在樣品總面積的比例, 看作是物種豐度[21]。

使用R語(yǔ)言(R-3.2.3)程序包Vegan[22]計(jì)算多樣性指數(shù), 基于Bray-Curtis距離[23]量化樣本間群落結(jié)構(gòu)差異, 使用Adonis進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)[24],并進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析[25]、蒙特卡羅檢驗(yàn)(Monte Carlo permutation test)[26]。多樣性指數(shù)包括物種數(shù)(S), Shannon-Wiener指數(shù)(H′)[27]和Pielou指數(shù)(J′)[28]。典范對(duì)應(yīng)分析反映物種或樣點(diǎn)與環(huán)境因子間的關(guān)系。蒙特卡羅檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)群落結(jié)構(gòu)與理化因子相關(guān)性是否顯著(重復(fù)數(shù)為999)。

參考地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《GB 3838—2002》,綜合豐水期及枯水期數(shù)據(jù), 按水質(zhì)類別將水質(zhì)狀況分為優(yōu)(Ⅰ、Ⅱ類水質(zhì))、良(Ⅲ類水)、輕度污染(Ⅳ類水質(zhì))、中度污染(Ⅴ類水質(zhì))及重度污染(劣Ⅴ類水質(zhì))。使用R語(yǔ)言indicspecies程序包[29]進(jìn)行組間指示種分析, 分別篩選了代表優(yōu)(Ⅰ、Ⅱ類水)及重度污染(劣Ⅴ類水)潛在的敏感種和耐污種的末端限制性片段。并使用MICA工具進(jìn)行末端限制性片段對(duì)應(yīng)物種預(yù)測(cè)[30]。使用R語(yǔ)言vegan[22]程序包中的corr.test功能對(duì)物種(T-RFs)和理化因子進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析, 并使用corr.test檢驗(yàn)其相關(guān)性是否顯著(重復(fù)數(shù)為999)。

2 結(jié)果

2.1 真核微型生物多樣性

豐水期40個(gè)樣本中共發(fā)現(xiàn)133個(gè)不同的末端限制性片段, 代表了至少133個(gè)不同的物種。樣點(diǎn)末端限制性片段數(shù)目最少為2個(gè)(GG2_1), 最多為25個(gè)(XG5_1); 香農(nóng)威爾指數(shù)最小也為0.6734(GG2_1),最大為3.0611 (XG5_1); 均勻度指數(shù)最小為0.5564(XS5_1), 最大為0.9715 (GG2_1, 表1)。由此可見,珠江廣州段樣本GG2_1物種組成單一, 且末端限制性片段分布不均勻; 而西江廣東段樣本XG5_1物種組成較為多樣化, 且末端限制性片段分布較為均勻。

枯水期43個(gè)樣本中共發(fā)現(xiàn)167個(gè)不同的末端限制性片段, 末端限制性片段數(shù)目最少為10個(gè)(GC1_2、GG3_2、GN2_2、XN2_2), 最多為29個(gè)(XG1_2和XS1_2)。珠江廣州段樣本GN2_2的均勻度指數(shù)最小(0.5375), 香農(nóng)威爾指數(shù)也最小(1.2377),說(shuō)明該樣本物種組成單一, 且T-RFs分布不均勻。西江廣東段樣本XG1_2的均勻度指數(shù)最大(0.9493),香農(nóng)威爾指數(shù)也最大(3.1966), 其末端限制性片段數(shù)目雖多(29), 但各個(gè)物種的數(shù)量相差不大, 物種組成較為多樣化。

豐水期樣本與枯水期樣本的末端限制性片段數(shù)目與均勻度指數(shù)無(wú)顯著差異, 但是香農(nóng)威爾指數(shù)存在顯著差異(P＜0.05, 圖2a), 枯水期樣本多樣性指數(shù)普遍高于豐水期樣本(表1)。珠江廣州段樣本與西江廣東段樣本多樣性指數(shù)均存在顯著差異(P＜0.05,圖2b), 西江廣東段樣本多樣性指數(shù)普遍高于珠江廣州段樣本(表1)。

真核微型生物非度量多維尺度分析(圖3)顯示,豐水期40個(gè)樣本(WS)較枯水期43個(gè)樣本(DS)的分布更為分散, 珠江廣州段41個(gè)樣本(GZ)較西江廣東段42個(gè)樣本(XJ)的分布更為分散。Adonis分析表明豐水期與枯水期樣本之間、珠江廣州段與西江廣東段樣本之間的真核微型生物群落結(jié)構(gòu)均存在顯著差異(P＜0.05, 圖3)。

2.2 真核微型生物群落結(jié)構(gòu)及其與理化因子的關(guān)系

調(diào)查區(qū)域83個(gè)樣本中, 水質(zhì)類別為優(yōu)、良、輕度污染、中度污染和重度污染的樣本分別為3、7、9、7和57個(gè)。57個(gè)樣本的總氮(TN)、氨氮(AN)和總磷(TP)指標(biāo)均超過(guò)地表水劣Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn),為珠江水體主要污染指標(biāo)。枯水期樣本溫度、pH、鹽度和總磷顯著高于豐水期樣本(P＜0.05, 圖4a),其余所測(cè)理化因子在枯水期和豐水期無(wú)顯著差異。西江廣東段樣本化學(xué)需氧量顯著高于珠江廣州段樣本(P＜0.05, 圖4b), 其余所測(cè)理化因子在西江廣東段和珠江廣州段均無(wú)顯著差異。

豐水期樣本典范對(duì)應(yīng)分析(圖5a)和相關(guān)性檢驗(yàn)(表2)表明, 豐水期樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與溶氧量(DO)、化學(xué)需氧量(CODCr)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、氨氮(AN)、總氮(TN)和總磷(TP)顯著相關(guān)(P＜0.05), 其中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響最大的理化因子是總磷(TP), 相關(guān)系數(shù)(r2)為0.7885, 其次是氨氮(AN), 相關(guān)系數(shù)為0.6976。其余理化因子相關(guān)系數(shù)由大到小分別是高錳酸鹽指數(shù)(CODMn, 0.6797)、化學(xué)需氧量(CODCr, 0.6170)、溶氧量(DO,0.5599)、總氮(TN, 0.5397)。枯水期樣本典范對(duì)應(yīng)分析(圖5b)和相關(guān)性檢驗(yàn)(表2)表明, 枯水期樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)受溫度(Temp)、化學(xué)需氧量(CODCr)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、氨氮(AN)、總氮(TN)和總磷(TP)的顯著影響, 其中受總磷(TP)和高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)影響最大, 相關(guān)系數(shù)分別是0.9289和0.7950, 其次是化學(xué)需氧量(CODCr,0.6815)、總氮(TN, 0.6638)、氨氮(AN, 0.6352)、溶氧量(DO, 0.4449)和溫度(TP, 0.1695)。與豐水期相比, 枯水期樣本真核微生物群落結(jié)構(gòu)與造成污染的理化因子如總磷(TP)、總氮(TN)和化學(xué)需氧量(CODCr)等的相關(guān)系數(shù)要大于豐水期, 且溫度(Temp)對(duì)枯水期樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

珠江廣州段樣本典范對(duì)應(yīng)分析(圖5c)和相關(guān)性檢驗(yàn)(表2)表明, 珠江廣州段樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與溫度(Temp)、溶氧量(DO)、化學(xué)需氧量(CODCr)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、氨氮(AN)、

總氮(TN)和總磷(TP)顯著相關(guān)(P＜0.05), 其中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響最大的理化因子是高錳酸鹽指數(shù)(CODMn), 相關(guān)系數(shù)(r2)為0.8313, 其次是化學(xué)需氧量(CODCr), 相關(guān)系數(shù)為0.7687。其余理化因子相關(guān)系數(shù)由大到小分別是氨氮(AN, 0.6086)、總氮(TN,0.4973)、總磷(TP, 0.1925)、溫度(Temp, 0.1329)、溶氧量(DO, 0.1294)。西江廣東段樣本典范對(duì)應(yīng)分析(圖5d)和相關(guān)性檢驗(yàn)(表2)表明, 西江廣東段樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與溶氧量(DO)、化學(xué)需氧量(CODCr)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、氨氮(AN)、總氮(TN)和總磷(TP)顯著相關(guān)(P＜0.05), 其中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響最大的理化因子是總磷(TP), 相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9285, 其次是高錳酸鹽指數(shù)(CODMn),相關(guān)系數(shù)為0.8722。其余理化因子相關(guān)系數(shù)由大到小分別是氨氮(AN, 0.8681)、化學(xué)需氧量(CODCr,0.8200)、總氮(TN, 0.8047)、溶氧量(DO, 0.2305)。與珠江廣州段樣本相比, 西江廣東段樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與理化因子相關(guān)系數(shù)普遍更大, 但是

溫度對(duì)西江廣東段樣本真核微型生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表1 真核微型生物多樣性指數(shù)Tab. 1 Diversity index of microbial eukaryotes

圖2 不同水期(a)和采樣區(qū)域(b)多樣性指數(shù)箱線圖Fig. 2 The boxplots for diversity index of different water seasons or regions

圖3 不同水期(a)和不同區(qū)域(b)真核微型生物非度量多維尺度分析Fig. 3 The nMDS for microbial eukaryotes of different water seasons (a) and regions (b)

2.3 潛在指示物種篩選

為篩選潛在的對(duì)應(yīng)水質(zhì)指示物種, 參考地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《GB 3838—2002》, 在水質(zhì)類為優(yōu)(I、II類水)、良(III類水)、輕度污染(IV類水質(zhì))、中度污染(V類水質(zhì))、重度污染(劣V類水)的樣本組間進(jìn)行組間指示末端限制性片段篩選(表3)。篩選出1個(gè)末端限制性片段, 片段長(zhǎng)度為76 bp, 可能只存在于“優(yōu)”級(jí)水質(zhì), 而在水質(zhì)為其余類別的水體中基本不存在或數(shù)量非常少。篩選出了8個(gè)末端限制性片段, 只存在或大量存在于“重度污染”水體中,片段長(zhǎng)度分別為83、117、192、235、376、377、391和406 bp。基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 潛在的敏感物種可能為后鞭類(Opisthokonta)的Cystobasidiumsp. 或變形類(Amoebozoa)的Protostelium nocturnum; 潛在的耐污物種可能為后鞭類(Opisthokonta)的Candida caryicola、梅奇酵母科(Metschnikowiaceae)或釀酒酵母目的未定科(Saccharomycetales incertae sedis)物種; 原始色素體生物(Archaeplastida)的Coccomyxa simplex、Botryosphaerella sudetica以及輪藻科(Characeae)、衣藻科(Chlamydomonadaceae)物種;變形類(Amoebozoa)的Acanthamoeba hatchetti; 囊泡類(Alveolata)的Sulfonecta uniserialis、Stenophora robusta、Theileriasp.、Babesia bicornis以及鐘形蟲科(Vorticellidae)和隱孢科(Cryptosporidiidae)物種; 隱藻類(Cryptophyceae)的Cryptomonas ovata; 不等鞭毛類(Stramenopiles)的Filos agilis和Blastocystissp.。

3 討論

本研究T-RFLP數(shù)據(jù)表明, 豐水期與枯水期水體中的真核微型生物香農(nóng)威爾指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(圖2a、圖3a)。前人研究也表明季節(jié)是影響真核微型生物群落組成的重要因素, 例如：Countway等[31]報(bào)道同一樣點(diǎn)不同季節(jié)的真核微型生物物種組成有顯著差異; 北太平洋東部海域的真核微型生物群落存在顯著的季節(jié)和年度差異[32]。與此同時(shí), 本研究發(fā)現(xiàn)珠江廣州段和西江廣東段真核微型生物多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)也存在顯著差異(圖2b、圖3b), 表明地域甚至是小范圍的地理位置差異對(duì)真核微型生物多樣性有著顯著的影響。同樣, 先前文獻(xiàn)報(bào)道, 青島、廈門和湛江沿岸灘涂真核微型生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異[33]; 美國(guó)黃石公園不同樣點(diǎn)間真核微型生物群落相似性較低[34]。考慮到時(shí)間和地域的差異對(duì)物種多樣性有顯著的影響, 我們建議在利用真核微型生物監(jiān)測(cè)水質(zhì)時(shí),必須建立在全面了解該地區(qū)不同時(shí)期、不同地點(diǎn)的真核微型生物多樣性的基礎(chǔ)上。

圖4 不同水期(a)和不同區(qū)域(b)的理化因子箱線圖。Fig. 4 The boxplots for physicochemical factors of different water seasons (a) and regions (b)

我們的研究數(shù)據(jù)表明, 珠江廣州段和西江廣東段水體受到氮、磷的嚴(yán)重污染, 普遍處于劣V類(57個(gè)樣本, 占據(jù)了69%); 豐水期總磷濃度普遍低于枯水期, 西江廣東段化學(xué)需氧量濃度普遍高于珠江廣州段(圖4)。排序分析和相關(guān)性檢驗(yàn)(圖5、表2)表明, 真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與化學(xué)需氧量、高錳酸鹽指數(shù)、氨氮、總氮、總磷等水質(zhì)監(jiān)測(cè)相關(guān)理化因子顯著相關(guān), 能夠較好地反映水質(zhì)狀況。化學(xué)需氧量和高錳酸鹽指數(shù)代表著樣點(diǎn)受有機(jī)物污染的程度[35], 其對(duì)真核微型生物群落結(jié)構(gòu)有著顯著的影響[36,37]。過(guò)量的氨氮會(huì)影響細(xì)胞膜穩(wěn)定性及酶水解反應(yīng), 導(dǎo)致生物代謝緩慢, 嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致生物死亡[38], 文獻(xiàn)報(bào)道原生生物、金藻、硅藻與氨氮之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)[12]。總氮和總磷通過(guò)影響浮游藻類的光合作用對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控, 從而又影響了異養(yǎng)真核微型生物類群[39—43]。總氮和總磷是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要理化因子[44], 此類營(yíng)養(yǎng)鹽主要來(lái)源于工業(yè)廢水和生活污水, 而西江廣東段與珠江廣州段周邊工業(yè)廢水和生活污水排放量巨大[15]。此外, 本研究發(fā)現(xiàn), 研究區(qū)域總氮和總磷的季節(jié)性變化不明顯, 但枯水期高于豐水期, 這可能是由于豐水期水量大, 物理稀釋作用導(dǎo)致總氮和總磷濃度降低, 也可能是因?yàn)樨S水期水生生物活動(dòng)頻繁, 大量消耗了水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽[35]。

圖5 豐水期樣本(a)、枯水期樣本(b)、珠江廣州段(c)和西江廣東段(d)樣本真核微型群落結(jié)構(gòu)與理化因子典范對(duì)應(yīng)分析Fig. 5 Canonical correspondence analysis (CCA) between physicochemical factors and microbial eukaryotic community structures of wet season (a), dry season (b), Guangzhou Reach of the Pearl River (c) and Guangdong Reach of the Xijiang River (d)

表2 真核微型生物群落結(jié)構(gòu)與理化因子相關(guān)性檢驗(yàn)Tab. 2 Correlation test between the microbial eukaryotic community structures of samples and physicochemical factors

表3 潛在的水質(zhì)指示片段Tab. 3 Potential indicative T-RFs

某些真核微型生物, 會(huì)出現(xiàn)或大量存在于在不同污染程度的水域中, 從而可以作為水質(zhì)評(píng)判的指示物種。許恒龍等[12]發(fā)現(xiàn)Peridinium(多甲藻蟲屬)的某些物種在較為清潔的水體中豐度較高, 可作為潛在的敏感類群。楊金鵬等[45]發(fā)現(xiàn)Uronemella(尾絲蟲)在富營(yíng)養(yǎng)水體中有較高的豐度, 可作為潛在的耐污類群。本研究分別篩選出1個(gè)、8個(gè)末端限制性片段作為候選的敏感和耐污片段, 并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)給出了大致的物種/類群信息, 但由于缺乏具體的堿基信息, 這些片段具體代表哪些物種還有待進(jìn)一步研究。

致謝：

感謝華南師范大學(xué)本科生張寶丹、陳靜慧、陳俊宇在部分樣品采集和實(shí)驗(yàn)操作中給予的幫助。