額爾齊斯河流域不同來源哲羅鮭形態及COⅠ基因比較研究

郭愛民 喀迪爾丁·艾爾肯 焦 麗 郝翠蘭 陳 琳 潘國強 謝志勝張文潤 容夢婕 岳 城

(1. 新疆農業大學動物醫學學院, 烏魯木齊 830052; 2. 新疆眾力洋漁業科技有限公司, 烏魯木齊 830052;3. 布爾津縣額河特有冷水魚繁育開發有限公司, 布爾津 836600)

異域物種形成(Allopatric speciation)理論認為,同一物種的種群若發生地理隔離, 就會阻止種群間的基因流, 經過長期的基因突變、自然選擇和環境因素的共同作用后, 隔離形成的不同小種群會逐漸適應不同的生態環境, 逐步形成不同的地理宗或生態型(Geographic race), 不同的地理宗或生態型在分別獨自進化, 可形成不同的種[1]。

太門哲羅鮭(Hucho taimen)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、哲羅鮭屬(Hucho)[2],是大型冷水性淡水兇猛魚類, 在1998年出版的《中國瀕危動物紅皮書·魚類》中被列為中國的瀕危物種[3]。哲羅鮭在新疆俗稱“大紅魚”, 因著名的喀納斯湖“湖怪”傳說, 而受到世人廣泛關注, 成為額爾齊斯河的乃至新疆的生物名片[4]。20世紀60年代,哲羅鮭在額爾齊斯河流域, 包括布爾津河、哈巴河和喀納斯湖, 以及黑龍江流域的黑龍江、松花江、牡丹江、烏蘇里江等廣泛分布[5—9]。研究顯示在第三紀早、中期額爾齊斯河流域和黑龍江流域通過西伯利亞水系相連, 起源于西伯利亞的鮭科魚類在各流域間相互交流、擴散, 到中晚期水體萎縮、河湖分隔漸趨明顯, 在第三紀末, 西伯利亞水域和黑龍江流域的魚類區系已產生很大的差別[10]。李思忠[11]認為額爾齊斯河流域和黑龍江流域的魚類區系組成相似但有一定差異, 1981年將兩個流域劃為北方區的額爾齊斯河亞區和黑龍江亞區。有學者認為兩個流域的哲羅鮭長期存在地理隔離, 缺乏基因交流, 逐漸適應各自的生活環境, 獨自演化繁衍,已產生一定的差異[12,13], 董崇智等[5]的形態學研究表明來自額爾齊斯河的哲羅鮭比黑龍江的哲羅鮭側線鱗、幽門盲囊數稍多。未見應用分子生物學的方法對兩地的哲羅鮭進行比較研究。

由于生態環境改變、過度捕撈等人為原因和哲羅鮭個體大、性成熟晚、個體產卵量小等生物學特性, 我國哲羅鮭的群體數量急劇下降, 分布區域迅速縮小[1,6,14]。世界自然保護聯盟(IUCN)2011—2012年期間對世界范圍內的哲羅鮭進行了瀕危等級評估, 中國太門哲羅鮭(H. taimen)的等級為“瀕危”, 且新疆和黑龍江的哲羅鮭在過去3代(51年)的下降率分別約為87%和95%[15]。黑龍江流域的哲羅鮭人工繁育已獲成功, 額爾齊斯河流域的哲羅鮭由于野生種群數量稀少, 難以捕獲, 瀕臨滅絕。哲羅鮭因神秘的“湖怪”傳說使喀納斯湖聞名于世, 為順應相關需求和恢復其自然種群, 新疆由黑龍江引進了哲羅鮭進行養殖, 2011年將引進的4萬余尾哲羅鮭子一代放流到額爾齊斯河流域[16]。有專家認為額爾齊斯河和黑龍江存在地理隔離, 兩地分布的哲羅鮭有差異, 也有專家表示兩地的哲羅鮭是同一種,學者們各執己見, 沒有充足的理論依據, 故哲羅鮭引種、養殖及放流的合理性、科學性存在的爭議。

我們在野外采樣工作中得到了數尾哲羅鮭, 為比較兩地哲羅鮭的異同, 我們同時采集了當地引進的哲羅鮭, 進行了形態學觀察, 擴增COⅠ基因, 進行了基因差異的研究, 以探究額爾齊斯河流域野生哲羅鮭和引進的哲羅鮭的差異, 以期為哲羅鮭的引種放流和土著物種的保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 魚樣采集

將額爾齊斯河流域白哈巴河采集到的哲羅鮭標記為HuchoBHB, 將額爾齊斯河流域的布爾津縣某水庫采集到的哲羅鮭標記為HuchoBEJ, 將布爾津縣某冷水魚養殖公司引進的黑龍江哲羅鮭標記為HuchoHLJ。分別從3個來源的哲羅鮭尾鰭剪切小塊組織(約0.3 cm×0.5 cm×1.0 cm)放入1.5 mL Eppendorf管中, 加95%酒精保存。

1.2 形態學觀察

由于標本魚為活體, 主要觀察了哲羅鮭的外部形態, 未對幽門盲囊數等內部特征進行解剖觀察。

1.3 分子生物學研究

DNA 提取將95%酒精保存的鰭條各剪取約20 mg, 用濾紙擦干酒精后剪碎, 放入1. 5 mL離心管中用Omega軟體動物DNA小量提取試劑盒提取DNA。相關操作依據試劑盒說明書進行。

基因擴增及測序PCR擴增采用標準的25 μL體系, 2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, 1 pmol/μL上下游引物各1 μL, 10 ng/μL的模板2 μL, ddH2O 8.5 μL。COⅠ正向引物為TyrCOⅠ： 5′-CTGTTTAT GGAGCTACAATC-3′,COⅠ反向引物為SerCOⅠ：5′-GTGGCAGAGTGGTTATG-3′[17]; 反應程序為：94℃預變性5min; 94℃變性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸90s, 30個循環; 最后72℃延伸10min。PCR反應結束后, 將擴增產物經1%瓊脂糖電泳分析, 目的條帶切膠后用OMEGA公司的膠回收試劑盒進行純化, 純化產物連接到pEASY-T1載體上, 并轉入感受態大腸桿菌DH5α細胞中, 經藍白斑篩選后, 選取2個陽性克隆送上海生物工程股份有限公司測序。純化產物送上海生工生物公司進行測序。

序列比對及系統發育樹構建從GenBank中下載所有含有哲羅鮭COⅠ基因的序列共來自10個樣本以及一條圖們江細鱗鮭序列作為外類群(表1), 用mega 6.0將下載序列與本研究得到的3個序列進行比對, 刪除兩端無法對齊的堿基, 用最大似然法和鄰近法構建系統發育樹并計算遺傳距離進行分析。

2 結果

2.1 形態學特征

HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ的形態相似, 體長形, 略側扁, 呈圓筒形; 頭部略扁平, 有許多的黑色圓斑; 口端位, 口裂大; 吻略尖, 上頜較下頜略突出; 上頜骨明顯、游離, 其末端延伸到眼后緣之后; 眼側上位, 眼間距寬; 鼻孔1對, 位于眼前上方, 距眼較距吻端近; 上、下頜骨、犁骨、腭骨和舌上均有向內傾斜的銳齒; 體被橢圓形小鱗,鱗前端較尖而后端較鈍; 側線完全, 位于體中側;背鰭起點處于體中部稍前, 胸鰭側下位, 起點稍后于腮蓋膜后緣, 腹鰭位于背鰭基后端之下, 胸、腹鰭較小, 腹鰭基部有腋鱗, 臀鰭與脂鰭相對應; 體側有多數密集如粟粒狀的暗黑色小十字形斑點。但HuchoBHB背部為蒼青色, 腹部銀白色, 斑點小,斑點少而淡, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ的背部為黑褐色, 斑點大, 斑點黑而密, 皮色不通透(圖1)。董崇智等[1]此前對黑龍江流域和額爾齊斯河流域的哲羅鮭進行了詳細的形態學測量及解剖學研究(表2)。

2.2 分子生物學結果比較

電泳結果顯示COⅠ基因片段大小約為1600 bp,這與預期結果一致; 測序所得序列與從GenBank下載序列進行比對、計算遺傳距離并構建系統發育樹(圖2、圖3)。

表1 來自GenBank的哲羅鮭基因序列Tab. 1 Gene sequences of Hucho from GenBank

從基于COⅠ基因的ML樹看,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H. taimen)聚為一個大的分支, 在這個大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H.taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一個獨立的分支。這個大的分支又與我國的川陜哲羅鮭(H.bleekeri)和歐洲的多瑙哲羅鮭(H. hucho)聚成的分支形成一個總的分支。NJ樹的結果與ML樹結果相一致。

圖1 額爾齊斯河流域不同來源哲羅鮭的形態Fig. 1 Morphologes of different sources of Hucho in the Irtysh River basin

從基于COⅠ基因的遺傳距離看(表3), 川陜哲羅鮭(H. bleekeri)與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間距離為0.0127—0.0160, 川陜哲羅鮭(H. bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離為0.0140—0.0166,多瑙河哲羅鮭(H. hucho)與太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0134—0.0160, 說明哲羅鮭的屬間距離大約在0.0127—0.0160; 已發布的各太門哲羅鮭(H. taimen)相互間的遺傳距離為0—0.0038, 說明太門哲羅鮭的種間遺傳距離在0.0038左右。HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0—0.0031,HuchoBEJ與俄羅斯阿穆爾河太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0006—0.0044,HuchoHLJ和HuchoBEJ的遺傳距離為0.0038, 與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間遺傳遺傳距離相一致;HuchoBHB與俄羅斯阿穆爾河、太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0.0057—0.0076,HuchoBHB與HuchoHLJ和HuchoBEJ的遺傳距離為0.0082和0.0057, 明顯大于太門哲羅鮭(H. taimen)的種間遺傳距離。HuchoBHB與川陜哲羅鮭(H.bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離為0.134—0.160, 與哲羅鮭的屬間遺傳距離(0.0127—0.0160)相一致, 這些結果說明HuchoHLJ、HuchoBEJ、HuchoBHB均為太門哲羅鮭(H. taimen), 但HuchoBHB與HuchoHLJ和HuchoBEJ及俄羅斯阿穆爾河分布的太門哲羅鮭(H. taimen)遺傳距離較大, 在基因上存在一定差異。

表2 不同水域哲羅鮭的主要性狀Tab. 2 Main traits of Hucho in different waters

圖2 基于哲羅鮭COⅠ基因的系統發育樹(ML)Fig. 2 Phylogenetic tree (ML) based on COⅠ gene of Hucho

3 討論

3.1 形態學特點

形態學觀察表明, 3種來源的哲羅鮭形態基本一致, 但存在部分差異：HuchoBHB背部為蒼青色,腹部銀白色, 斑點小, 斑點淡而少, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ背部為黑褐色, 斑點大, 斑點黑而密, 皮色不通透, 說明HuchoBHB與HuchoBEJ和HuchoHLJ在形態上有一定差異。本研究由于野生樣本為活體, 未對幽門盲囊數進行統計, 但據董崇智等[1]研究, 來自額爾齊斯河流域的哲羅鮭較黑龍江流域的哲羅鮭側線鱗、幽門盲囊數稍多, 表明2個流域的哲羅鮭在解剖構造上存在一定差異。

查閱各種含有哲羅鮭形態學描述的書籍發現不同專家對哲羅鮭的形態學描述略有不同, 如吻型特點, 石瓊等[24]、孫晨旭等[25]、袁國映[26]的描述是“吻尖”, 鄭葆珊[27]的描述是“吻鈍”, 而中國科學院動物所等機構聯合出版的《新疆魚類志》中的描述則是“吻略尖”[28]; 對于口位的描述, 鄭葆珊[27]的描述為“口前位”, 其他書籍中則描述為“口端位”[24—26];鱗片特點, 大多的描述為“鱗極細小, 橢圓形”[25—27],《新疆百科全書》[29]的描述則是“鱗片很小, 呈三角形”, 鄭葆珊[28]的描述則為“體背橢圓形小鱗, 鱗前端略尖, 后端較鈍”。我們認為, 導致這些形態描述特點不一致的原因可能跟樣本的采集地不同、樣本采集的時間、形態描述時的用詞差異等有關。

圖3 基于COⅠ基因的哲羅鮭系統發育樹(NJ)Fig. 3 Phylogenetic tree (NJ) based on COⅠ gene of Hucho

表3 基于哲羅鮭COⅠ基因的遺傳距離矩陣Tab. 3 Genetic distance matrix based on the COⅠgene of Hucho

3.2 基因序列差異

由系統發育樹可看出,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河(中國稱黑龍江)的太門哲羅鮭(H. taimen)聚為一個大的分支, 在這個大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H. taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一個獨立的分支。由遺傳距離矩陣可看出,HuchoBEJ和HuchoHLJ與俄羅斯阿穆爾河太門哲羅鮭(H. taimen)的遺傳距離為0—0.0044,與太門哲羅鮭(H. taimen)的種間距離相一致, 說明HuchoBEJ和HuchoHLJ為太門哲羅鮭(H. taimen);HuchoBHB與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H.taimen)的遺傳距離(0.0057—0.0076)約為太門哲羅鮭(H. taimen)種間距離(0—0.0038)的兩倍, 與川陜哲羅鮭(H. bleekeri)和多瑙河哲羅鮭(H. hucho)的遺傳距離(0.0134—0.0160)與哲羅鮭的屬間遺傳距離(0.0127— 0.0160)相一致, 說明HuchoBHB為太門哲羅鮭(H. taimen), 但與俄羅斯阿穆爾河的太門哲羅鮭(H. taimen)在基因上的存在較大差異。

3.3 三個不同來源哲羅鮭的關系

相關研究表明冷水魚對冷水產卵環境具有獨特的選擇性, 和冷水魚強烈的返家繁殖習性及很弱的擴散能力, 地理種群間很容易因基因交流出現障礙而產生顯著的遺傳分化[30—33]。馬波等[34]的研究表明, 盡管水系相連, 但在嫩江上游、黑龍江、圖們江中的細鱗鮭表現出形態差異, 推測其為地理隔離導致的遺傳分化, 認為圖們江的細鱗鮭是尖吻細鱗鮭的一種特殊的地理生態類群。

我們的研究結果在形態學表征和分子數據皆顯示, 額爾齊斯河流域和黑龍江流域的哲羅鮭由于長期的地理隔離, 適應不同的地理環境, 進化繁衍, 從而在形態和基因上都產生了較大差異, 特別是基因序列方面, 來自額爾齊斯河流域的HuchoBHB與黑龍江流域的哲羅鮭在進化樹上形成單獨的分支, 遺傳距離為黑龍江流域哲羅鮭種間距離的兩倍, 可作為太門哲羅鮭(H. taimen)的不同生態地理類群。而HuchoBEJ與HuchoHLJ及俄羅斯阿穆爾河的哲羅鮭(中國稱黑龍江)在進化樹上聚到了一起, 遺傳距離為0—0.0044, 與太門哲羅鮭中間距離相一致, 我們推測HuchoBEJ為當年放流或養殖場逃逸的哲羅鮭。

3.4 關于引種問題的探討

外來種(Alien or exotic species)是指那些出現