美洲黑石斑遲緩愛德華氏菌分離、鑒定及致病性研究

吳 靜 王庚申 柳敏海 李偉業, 汪 瑋 施 慧許文軍 謝建軍 何 杰

(1. 浙江海洋大學水產學院, 舟山 316000; 2. 浙江省海洋水產研究所, 浙江省海水增養殖重點實驗室, 舟山 316000;3. 舟山市水產研究所, 舟山 316000; 4. 寧波大學, 寧波 315000)

美洲黑石斑(Centropristis striata), 又稱條紋鋸鮨和黑鋸鮨, 俗稱黑石斑。屬鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus),原產于美國大西洋和墨西哥沿岸。因其肉質肥美、口感滑而不膩, 而且生長速度快, 病害少, 易于養殖, 深受美國和加拿大消費者歡迎。2002年, 我國首次引入美洲黑石斑并進行了育苗試驗, 2006年實現規模化生產并逐步走向網箱、工廠化養殖, 如今美洲黑石斑已成為非常有前景和市場價值的養殖對象[1,2]。

目前, 國外關于美洲黑石斑的研究主要集中在健康養殖與繁育、生態漁業評價和生物學等方面,Copeland等[3]研究了野生美洲黑石斑以四種不同密度圈養在循環池系統中的生長與飼料利用; Alam等[4]研究了美洲黑石斑幼魚的膳食蛋白需要量;Weirich[5]研究了美洲黑石斑幼魚在不同鹽度下對急性氨和亞硝酸鹽暴露的耐受性; 國內對美洲黑石斑的研究主要集中在營養成分[6]、育苗及養成技術等方面, 李海燕等[7]用解剖和光鏡技術觀察了美洲黑石斑消化道的形態及組織學結構; 邱金海等[8]對美洲黑石斑進行了營養成分分析與營養價值評價,但涉及病害方面的研究報道很少。2018年7月, 舟山市水產研究所圍塘養殖的一批美洲黑石斑幼齡魚暴發性死亡, 死亡率達30%。病魚活動緩慢, 沉于養殖池底部。魚體表完好未見異常, 解剖病魚發現, 魚鰓絲上白點明顯, 脾臟和腎臟組織均布滿1—2 mm左右灰白色小結節, 肝臟未見結節。本課題組從發病魚體內臟組織分離純化到一株致病菌,開展了致病性、細菌形態學、生理生化, 分子生物鑒定、藥敏試驗以及組織病理和電鏡超微病理切片等研究, 以期為美洲黑石斑健康養殖和疾病防治提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

發病美洲黑石斑于2018年7月采集自舟山市水產研究所, 體長10—12 cm, 體重40—50 g, 選取臨床表現出特征性的鰓絲蒼白的病魚。人工感染試驗材料為舟山市水產研究所健康美洲黑石斑, 體長12—14 cm。

主要試劑： 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購于青島高科園海博生物技術有限公司, TCBS瓊脂購于杭州濱和微生物試劑有限公司, 細菌基因組DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司, 藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司,TaqDNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa公司。

1.2 病原菌分離培養

取臨床表現出典型病癥的瀕死病魚, 取鰓絲、體表黏液及腸道內容物等制成水浸片, 顯微鏡下觀察。用75%酒精棉球對病魚體表消毒后, 在無菌條件下取病魚肝臟、腎臟小塊, 進行組織勻漿, 并劃線接種于常規細菌培養基胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和弧菌選擇性培養基(TCBS)培養基上, 28℃培養24—48h, 觀察細菌生長情況。挑選形態一致的菌株純化培養, 將純化后的菌株置于30%甘油溶液中-80℃保存備用。

1.3 形態學觀察和生理生化特性鑒定

挑取TSA培養基上純化培養的菌落, 進行革蘭氏染色, 并在顯微鏡下觀察其菌落形態和大小。采用API 20E試劑盒鑒定其生理生化特性, 具體操作按照試劑盒說明進行。

1.4 藥敏試驗

將優勢菌株接種于TSA培養基上, 經28℃純化培養48h后, 加入無菌生理鹽水制成菌懸液, 采用紙片擴散法, 取100 μL制備的菌懸液(經顯微鏡計數約為109CFU/mL)涂布于TSA平板, 用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕貼在平板表面, 28℃恒溫培養24h后測定抑菌圈直徑, 根據說明書的標準確定分離菌株對不同抗生素的敏感性。

1.5 人工感染實驗

將分離到的優勢菌株經TSA培養基28℃培養48h后, 用0.85%的無菌生理鹽水制成菌懸液。采用分光光度法測定菌液濃度, 配置1×107、1×106和1×105CFU/mL的菌懸液。選擇規格均一、有活力的健康美洲黑石斑進行回感實驗(體重80 g左右, 體長12—14 cm), 每組7尾魚, 每個感染組設一個平行對照分別對應A、B、C組, 并設1個空白對照組。采用腹腔注射法對美洲黑石斑進行人工感染實驗,每尾魚注射1.5 mL菌懸液, 空白對照組注射等量的0.85%生理鹽水。試驗水溫26℃, 連續充氣, 不投喂, 每天換水量為30%, 連續觀察7d, 記錄發病癥狀和死亡情況。并對瀕死病魚進行重分離實驗。

1.6 組織病理學觀察

光鏡樣品制備及觀察選擇鰓部白點癥狀明顯的發病魚, 分別取其肝、脾及腎等組織經Bouin氏液固定, 在24h后換數次75%乙醇沖洗, 最后保存于75%的乙醇中。固定樣品經后續乙醇系列及丙酮脫水過程, 移入二甲苯溶液中透明, 浸蠟包埋后切片, 烤干后展片以蘇木精-伊紅染色法(HE 染色) 染色, 中性樹膠封片, 顯微鏡下觀察拍照[9—11]。

電鏡樣品制備及觀察選擇患病活魚, 將病魚肝、脾及腎等內臟組織切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊分別固定于2.5%戊二醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.4) 中, 4℃固定4h以上。在0.1 mol /L磷酸緩沖液中4℃漂洗過夜后再用1%鋨酸溶液固定, 經過一系列濃度的乙醇脫水, 樣品塊經環氧樹脂包埋后制備超薄切片, 在透射電鏡下觀察拍照[12,13]。

1.7 分離菌16S rDNA基因序列測定及系統發育樹構建

利用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌的全基因組DNA作為PCR模板。采用細菌16S rDNA通用擴增引物, 正向引物27F： 5′-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3′, 反向引物1492R： 5′-TACG GYTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海生物工程公司合成。

PCR反應體系為50 μL： 10×PCR緩沖液5 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,Taq聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,10 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL, 1 μL模板, 其余用無菌去離子水補足。

PCR反應條件： 94℃預變性5min, 94℃變性1min, 56℃退火45s, 72℃延伸1min, 30個循環, 72℃延伸10min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由上海生物工程公司測序。

運用DNAMAN 軟件對獲取的基因序列進行排序、比對, 同時應用NCBI 中BLAST軟件對測得的基因序列進行同源檢索。從GenBank中下載同源性較高基因序列作參考, 使用MEGA3.1分析軟件,Kimura-2法計算遺傳距離, 并采用bootstrap (重復次數1000)進行自舉分析, 鄰接法構建分子發育樹。

2 結果

2.1 解剖觀察與臨床癥狀

發病池塘水溫29℃左右, 發病魚多為體長12 cm左右的幼魚, 該病日死亡率在1%以上。病魚體表完好、無潰瘍等異常病癥。解剖瀕死活魚, 主要病癥表現為鰓部白點明顯; 肝臟發白; 脾臟腫大, 布滿白色結節; 頭腎、后腎腫大, 布滿白色結節; 心臟上偶見有白色結節(圖1); 將組織器官上的白色結節壓片后, 革蘭氏染色可見大量陰性短桿菌(圖2)。

圖1 患病美洲黑石斑魚及其解剖圖Fig. 1 Sick black seabass and its anatomy

2.2 寄生蟲檢測和細菌分離

對采集病魚樣本的體表黏液、鰓絲、腸道內容物等進行顯微鏡檢, 均未發現致病性寄生蟲。在無菌條件下, 使用細菌培養基TSA和TCBS對病魚的肝、腎和脾等內臟組織進行細菌分離培養, 28℃培養24—48h后觀察。在24h后, TSA和TCBS未發現有優勢致病菌出現, 48h在TSA培養基上長出直徑約1 mm, 表面濕潤、隆起的灰白色菌落。TCBS上為綠色、直徑約1 mm左右的細小菌落。

2.3 形態特征及生理生化試驗結果

分離菌ZS201807經革蘭氏染色后為陰性、桿狀菌, 其大小約0.5 μm×2 μm, 可運動。采用API 20E系統鑒定分離菌, 其主要生理特征為賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶陽性, 精氨酸雙水介酶、鄰硝基苯-半乳糖苷酶、脲酶、明膠酶陰性, 產生H2S,不形成吲哚, 不利用檸檬酸, V-P試驗陰性, 氧化酶陰性, 能發酵葡萄糖, 不能利用甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖產酸。鑒定結果與文獻[14]遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)生理生化特征基本一致, 初步將ZS201807鑒定為遲緩愛德華氏菌(表1)。

2.4 藥敏試驗

利用27種抗生素對分離菌進行藥敏試驗(表2)。用紙片法測得分離菌株對環丙沙星、頭孢曲松、諾氟沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星、四環素、恩諾沙星等14種藥物敏感; 對青霉素、阿奇霉素、丁胺卡那、妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、萬古霉素等13種藥物耐受。

2.5 16S rDNA基因序列分析結果

通過PCR反應擴增, 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得1400 bp的特異性條帶。經測序獲得16S rDNA基因序列, 與GenBank中已登陸的核酸序列進行BLAST分析, 采用MEGA軟件構建系統發育樹, 結果顯示分離菌與愛德華氏菌屬自然聚為一分支, 分離菌的16S rDNA基因序列與遲緩愛德華氏菌最為相似, 同源性高達99% (圖3)。結合生理生化鑒定結果, 進一步確定ZS201807為遲緩愛德華氏菌。

2.6 人工感染實驗

用分離到的優勢菌對健康美洲黑石斑進行腹腔注射感染實驗, 接種后第2天開始出現死亡。A組在感染4d后全部死亡, B組在7d內死亡率為28.6%,C組在7d內死亡率為0, 對照組在實驗期間無發病癥狀、無死亡(表3)。人工感染試驗發病魚表現的臨床癥狀與自然發病魚的相似, 活力下降, 解剖病死魚, 脾臟腫大并有大量白色結節, 但鰓部和其他內臟組織未見白色結節(圖4); 從感染魚分離得到的優勢菌與ZS201807菌落形態、生理生化特征基本一致, 經16S rDNA基因序列測定與回感菌株一致,證實分離菌株ZS201807是導致此次美洲黑石斑暴發性死亡的病原菌。

2.7 組織病理切片觀察結果

在普通光學顯微鏡下觀察病魚的組織病理切片, 發現病魚的肝臟、腎臟等組織有嚴重的病理變化。病魚肝臟中可見明顯的細胞腫脹, 血管內出現輕微溶血, 肝細胞界限模糊, 細胞間質增寬, 細胞核濃縮或崩解消失(圖版Ⅰ-1); 脾臟組織細胞壞死, 大量紅細胞浸潤, 出現嚴重瘀血, 在紅髓和白髓區均可見散在的壞死灶, 壞死灶內實質細胞界限模糊不清, 有淋巴細胞浸潤(圖版Ⅰ-2); 鰓絲末端膨大, 鰓絲毛細血管擴張, 鰓小片腫脹、排列不規則呈波狀扭曲, 嚴重的鰓小片上皮細胞與毛細血管分離, 淋巴細胞浸潤(圖版Ⅰ-3); 病魚腎組織壞死、大量淋巴細胞浸潤, 腎小管管腔狹窄, 部分腎小管閉塞, 失去原有結構, 上皮細胞腫脹界限模糊不清晰、細胞核空泡化; 腎小球腫大, 嚴重的崩解, 囊腔變窄, 細胞空泡化(圖版Ⅰ-4); 頭腎出現大面積組織壞死和崩解并形成壞死灶, 部分壞死組織淀粉樣變性, 血竇擴張, 瘀血(圖版Ⅰ-5); 病魚心肌纖維結構松散、紊亂, 心肌退化變性, 胞質液化呈均質玻璃樣病變,部分心肌細胞壞死(圖版Ⅰ-6)。

圖2 白色結節壓片革蘭氏染色Fig. 2 White nodule tablet with gram-stained

表1 分離菌生理生化鑒定結果Tab. 1 Physiological and biochemical identification results of isolated bacteria

表2 藥敏試驗結果Tab. 2 Results of drug sensitivity test

圖3 根據分離菌16S rDNA基因序列構建的系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of isolated bacteria

表3 美洲黑石斑腹腔注射感染試驗結果Tab. 3 Mortality of black seabass infected by intraperitoneal injection

圖4 人工感染實驗魚解剖圖Fig. 4 Anatomical map of artificial infection experimental fish

2.8 超微病理

內臟組織超薄切片電鏡觀察結果顯示, 心、肝、腎等組織在電鏡下未觀察到細菌, 但病魚脾臟和頭腎組織有大量細菌侵染, 細胞結構破壞嚴重。病魚脾臟和頭腎組織中有大量桿狀細菌積聚, 與壞死細胞形成結節, 細胞結構遭到嚴重破壞(圖版Ⅱ-1、2); 細胞間有大量不同切面的細菌菌體, 菌體的細胞壁電子密度較高(圖版Ⅱ-3), 細菌正在以出芽的方式生長發育, 并有大量的芽孢出現(圖版Ⅱ-4)。

3 討論

3.1 內臟白點病病原

細菌病是影響海水魚類養殖的主要病害之一,內臟白點病是近年海水魚類養殖中比較常見的疾病。目前, 引起海水魚類內臟白點病的病原種類很多, 邱楊玉[15]在患內臟白點病大黃魚(Larimichthys crocea)內臟中分離鑒定到一株病原菌, 經生理生化和分子生物學方法確定為惡臭假單胞菌(Pseudo-monas putida); 羅霞等[16]從患內臟白點病的斑鱧(Channa maculata)的肝、脾、腎組織中分離一株致病菌GC1, 得到1502 bp的16S rRNA基因序列, 與舒氏氣單胞菌(Aeromonas schubertii)同源性達到99%; 張靜等[17]對導致網箱養殖鱸魚(Lateolabrax japonicus)內臟白點病的致病菌進行了16S rRNA和HSP60基因序列分析, 結果鑒定致病菌株為哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)。在本實驗中患病美洲黑石斑脾、腎內臟組織有明顯白色結節, 從發病魚中分離到一株優勢菌株ZS201807, 人工感染試驗結果顯示, 菌株ZS201807在健康美洲黑石斑上復制出相同的臨床癥狀, 說明本實驗分離到的菌株ZS201807是引起此次美洲黑石斑發病死亡的病原菌。該菌株革蘭氏染色后為陰性、短桿狀菌, 采用通用引物擴增了該菌的16S rDNA序列, 并對擴增片段進行了序列測定與系統發育分析, 結果表明該菌株16S rDNA基因與遲緩愛德華氏菌的同源性最高, 達99%, 從而在分子生物學水平上將菌株ZS201807鑒定為遲緩愛德華氏菌。

3.2 感染遲緩愛德華氏菌癥狀及致病性

遲緩愛德華氏菌(E.tarda)屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae), 愛德華氏菌屬(Edwardsiella), 最早在蛇中被發現, 1962年日本學者Hoshina首次報道在患病鰻鱺(Anguilla japonica)中發現遲緩愛德華氏菌。該菌分布范圍廣泛, 易感物種包括兩棲類、哺乳類、爬行類、魚類等多種動物以及人類,可引起人類的腸胃炎、流行性腹瀉和敗血癥等疾病。目前該菌在20多種魚類中引起病害, 遲緩愛德華氏菌作為病原菌的研究在牙鲆(Paralichthys olivaceus)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等魚種中均有報道[20—22]。不同的魚類感染遲緩愛德華氏菌后所表現出的癥狀也不同, 患病鱖魚(Siniperca chuatsi)癥狀為腹部發紅、肛門紅腫, 肝臟、腸壁充血, 腹腔有血樣腹水[23]; 自然發病羅非魚(Tilapia nilotica)同樣出現腹部發紅、肛門紅腫突出, 不同的是腹腔內充滿氣體,有臭味, 膽囊高度充盈[24]; 本研究發病美洲黑石斑臨床癥狀未出現體表異常, 但鰓絲有明顯白點且黏液較多, 同時解剖病魚脾和頭腎等內臟組織有大量的白點結節, 但沒有出現文獻報道的眼球突出和渾濁、皮膚壞死和肌肉潰爛、肛門突出等臨床癥狀。劉春等[25]對斑馬魚(Danio rerio)進行了遲緩愛德華氏菌的致病性試驗, 當菌濃度達到1×107CFU/mL, 可以使試驗感染魚全部發病死亡, 與本文的人工感染實驗中實驗組美洲黑石斑全部發病死亡時菌液濃度一致。許曉蕓等[13]研究遲緩愛德華氏菌人工感染美洲鰻鱺(Anguilla rostrata)后, 組織病理類型表現為肝腎混合型, 而超微病理表現為腎臟型。本研究中美洲黑石斑組織病理主要集中在脾臟和腎臟組織, 但超微電鏡切片只在脾臟和頭腎組織中觀察到遲緩愛德華氏菌, 可能與不同魚種機體免疫機制差異有關。遲緩愛德華氏菌病在水產養殖中屬于常見的傳染病, 對水產養殖業帶來的經濟損失非常大。目前關于遲緩愛德華氏菌病的傳播途徑還沒有研究清楚, 有學者提出許多動物腸道攜帶遲緩愛德華氏菌以及水體里存在大量該菌, 可能會造成遲緩愛德華氏菌病的傳播[19]。

圖版 I 病魚肝臟、脾臟、鰓絲、腎臟、頭腎、心臟組織病理切片Plate I Pathological slices of liver, spleen, gill wire, kidney, head kidney and heart of diseased fish

圖版 Ⅱ 病魚脾、頭腎超微病理切片Plate Ⅱ Ultrastructural pathological section of spleen and head kidney of diseased fish

3.3 不同源遲緩愛德華氏菌抗藥性

目前治療遲緩愛德華氏菌病的主要手段是使用抗生素, 但不同源的分離菌株對抗生素的敏感程度也不一樣, 鱖分離到的遲緩愛德華氏菌對諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等抗生素高度敏感[23]; 患病澳洲寶石魚(Scortum barcoo)分離的遲緩愛德華氏菌對環丙沙星、紅霉素、氯霉素、萬古霉素等抗生素較為敏感, 對其他藥物中度或不敏感[26]; 大菱鲆分離到的遲緩愛德華氏菌株對先鋒霉素V、慶大霉素、氟哌酸、痢特靈等抗生素敏感[27]。在本研究中, 分離獲得的美洲黑石斑源遲緩愛德華氏菌對環丙沙星、四環素、恩諾沙星等14種藥物敏感;對青霉素、阿奇霉素、丁胺卡那等13種藥物耐受。所以在抗生素的使用上, 應該根據實際情況合理選擇, 其中一些禁藥應該嚴格排除。