Persisters的研究進展及清除策略

康佳寧

摘 要：Persisters是野生型細菌的一種表型變異，對抗生素具有高耐受性的休眠的細胞亞群，通過減少其新陳代謝并進入休眠狀態從而在抗生素治療中存活下來，并在抗生素去除后恢復生長，是造成抗生素治療頑固性和感染性疾病復發的主要原因之一。本文將對persisters的生物學特征、產生機制以及清除策略等內容作一綜述。

關鍵詞：persisters;毒素抗毒素系統;抗菌機制

Persisters這個概念是1944年都柏林大學醫學博士bigger首次提出的，他在研究青霉素殺死金黃色葡萄球菌的過程中發現，大部分細菌都被殺死但總有一小部分細菌培養物（約占細菌種群的1%）存活下來，存活下來的這部分細菌可以重新增殖并對青霉素保持相同的敏感性，為了與傳統意義上的耐藥菌相區分，他將這部分細菌命名為“persisters”。與眾所周知的由基因突變或水平基因轉移引起的抗生素耐藥性不同，persisters并沒有遺傳上的改變，最小抑菌濃度（MIC）不會增大，這種不發生任何抗性基因突變、僅以非增殖小亞群形式耐受抗生素的現象稱為“persistence” [1]。Persisters的特點可概括為低活性、多藥耐受、短暫表型性和生長異質性。休眠的persisters不會影響藥物與相應靶點的結合，但由于其低下的代謝活動，會導致抗菌藥物無法發揮殺菌作用，因而具有多種藥物耐受的特性。

1 Persisters的產生機制

Persisters形成機制不遵循復雜細胞功能的單個線性調節途徑的控制，它的形成機制比較復雜，受多種機制的調控，既可以自發隨機產生，又可以在環境壓力下誘導產生，目前對persisters的形成機制尚無定論，但普遍認為與營養限制、抗生素治療、ppGpp（鳥苷四磷酸）調控、毒素—抗毒素系統（TA系統）、代謝調節等有關系。

1.1? 營養限制

微生物在營養缺乏條件下生理機能將發生相當大的變化，這種變化發生在微生物群體生長的穩定階段。有文獻表明，細菌培養物在進入穩定期后開始積累persisters細胞。營養饑餓會觸發persisters形成，例如，當培養基中的氨基酸或氮缺乏，部分細菌會進入persisters狀態，導致抗生素治療失效[2]。

1.2ppGpp調控

鳥苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，PpGpp）作為胞內信號分子，介導細菌對環境脅迫產生的應激反應，是TA 系統的效應物質，主要參與細菌基因轉錄的調控。響應特定的壓力，SpoT和RelA被激活以合成核苷酸警報蛋白ppGpp。增加的ppGpp水平通過抑制胞外磷酸酶（PPX）導致無機多磷酸鹽（PolyP）的積累，降低PolyP。積累的PolyP與Lon蛋白酶優先結合，以裂解抗毒素HipB，導致過量的毒素HipA。作為回報，游離的活性毒素HipA通過其ATP結合位點Ser239的磷酸化使GltX失活，結果是不帶電荷的tRNA帶有谷氨酸（tRNAGlu）在細胞中積累。不帶電荷的tRNAGlu負載在空的核糖體位點，并觸發RelA激活更多ppGpp合成，從而促進細胞進入休眠狀態形成persisters細胞[3]。

1.3TA系統

毒素 - 抗毒素系統位于質粒上，其編碼能夠抑制細胞生長的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生長條件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在應激條件下，抗毒素被選擇性降解，釋放毒素以抑制必需的細胞過程，如DNA復制和蛋白質翻譯，從而導致生長停滯。TA系統在細菌耐藥性和persister形成中發揮重要作用。目前根據它們對應的抗毒素的蛋白質組性質及其不同的調節機制將TA系統分為六類，被稱為I-VI型TA系統。在I型和III型TA系統中，抗毒素是非編碼RNA;在II型，IV型，V型和VI型TA系統中，抗毒素是一種蛋白質。II型TA系統是目前研究最多的，I型，II型和V型，涉及persister的形成[4]。

I型TA系統具有非編碼RNA抗毒素和蛋白質毒素。在這個系統中，小分子反義RNA（sRNA）與毒素的mRNA堿基配對以抑制其翻譯。在正常生長條件下，這種雙鏈體抑制核糖體結合，并且迅速被RNase III降解。然而，在應激條件下，抗毒素sRNA庫減少，導致現在非雙鏈體毒素mRNA的翻譯。II型TA系統是最大和研究最多的TA系統類，在大多數自由生活細菌中鑒定出數千個II型TA基因座。II型TA系統抗毒素和毒素都是蛋白質，抗毒素通常具有兩個結構域，一個結合DNA，另一個結合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素兩個基因的表達是由TA復合物在轉錄水平上調控的，該復合物涉及到啟動子區域與回文序列的結合（抗毒素和大多數情況下TA復合物都結合TA啟動子以抑制轉錄。）。在生長條件下，毒素與抗毒素結合，后者抑制其活性。在應激條件下，活化細胞蛋白酶如Lon和ClpXP，其優先裂解抗毒素，釋放毒素以通過抑制翻譯或復制來抑制生長。V型系統中，抗毒素（GhoS）是一種RNase（核糖核酸內切酶），在生長條件下裂解毒素（GhoT）mRNA。在應激條件下，GhoS的mRNA被II型毒素MqsR降解。

第一個TA基因座tisAB-istR-1參與了SOS對DNA損傷的應答， 該基因座編碼一個有毒的基因tisAB和兩個小RNA，即IstR-1和IstR-2。TisAB受LexA控制，并因此受到SOS反應的激活，但只有TisB對毒性負責。 istR-2的轉錄也受SOS調節，不參與TisB的控制，而抗毒素IstR-1與LexA依賴的啟動子結合，并通過誘導tisB mRNA的RNase III依賴性切割來抑制TisB的表達。在沒有SOS應答的情況下，通過誘導tisB mRNA的RNase III依賴性切割，將istR-1組成性轉錄為滅活TisAB的毒性。當環丙沙星引起DNA損傷時，它會激活RecA蛋白，從而導致LexA阻遏物裂解，然后引發SOS反應?？刂芁ex啟動子的抗毒素IstR-1幾乎被完全裂解，而毒素TisB逐漸積累并迅速結合到細胞質膜上，導致膜損傷，質子動力（pmf）和ATP水平降低。這導致DNA，RNA和蛋白質合成的速率降低，并且阻止了細胞吸收藥物。結果，生長減慢并形成了耐多藥的persisters。

1.4代謝調節

任何參與細菌物質合成和能量代謝的過程都可能與persisters形成相關，其涉及機制和系統冗繁。Lon 蛋白酶參與大腸埃希菌多種抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株對氨芐西林和環丙沙星的persisters水平都降低，過表達Lon 蛋白的野生型細菌persisters水平明顯升高，然而對于缺失10 個編碼mRNA 內切酶的TA 基因座的突變株，persisters水平并沒有明顯變化[5]。營養缺乏激活Lon 或Clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，釋放HipA、RelE 等毒素蛋白。RelE裂解mRNA 或者通過ppGpp 依賴性信號轉導途徑誘導細胞生長停滯;HipA 能夠磷酸化谷氨酰- tRNA 合成酶（ glutamyl - tRNA synthetase，Glt X）的293 位絲氨酸并抑制其活性，導致空載glu - tRNA 增加，激活RelA 引起嚴謹反應，合成ppGpp，導致細菌停止生長。

2? 清除策略

研究發現[6]抗Perpersister化合物根據其作用機理，使用不同的策略殺死persisters細胞?？梢酝ㄟ^干擾群體感應（M64），SOS響應（lexA3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（NO）和嚴謹反應（relacin）來抑制persisters形成。其他策略包括通過刺激ROS的產生（Ag +，L-絲氨酸）或刺激細菌的新陳代謝，從而使persisters細胞對抗生素敏感，從而刺激抗生素靶標（C10，順式-2-癸烯酸）?；蛘撸梢酝ㄟ^改變pH梯度（L-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的攝?。↙-絲氨酸，次離子休克，代謝產物）來增加抗生素的攝取?？梢酝ㄟ^刺激非特異性蛋白酶活性（ADEP4，拉霉素），DNA交聯（絲裂霉素C，順鉑）或膜去極化（硼霉素，HT61，NCK-10）來直接殺死persisters細胞。直接殺死persisters細胞的最常見策略是通過廣泛破壞細菌膜。

3 展望

由于目前針對persisters形成機制研究的目標菌主要集中在大腸埃希菌，對于其他的細菌持留狀態研究較少，因此，需要加強對其他細菌持留狀態的研究，以進一步明晰不同細菌的持留機制是否具有保守性或差異性。尋找轉化persisters的藥物是控制慢性感染的關鍵，未來我們可以在中藥或者天然化合物中尋找能夠促進persisters向藥物敏感狀態轉化的物質，根據persisters產生的機制尋找藥物有效的作用靶點，也可以嘗試研究聯合用藥先將persisters轉化為抗生素敏感狀態，再利用抗生素徹底消滅的方法。

參考文獻：

[1]Bigger JW. Treatment of staphylococcal infections with penicillin. [J].Lancet 1944;244：497-500.

[2]Brown DR.Nitrogen starvation induces persister cell formation in Escheridhia coii.[J].Bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.

[3]Rocker A，Meinhart A.Type II toxin：antitoxin systems.More than small selfish entities.Current genetics，2016，62（2）：287-290.

[4]Równicki M，Pieńko T，Czarnecki J，et al.Artificial Activation of Escherichia coli mazEF and hipBA Toxin-Antitoxin Systems by Antisense Peptide Nucleic Acids as an Antibacterial Strategy.Frontiers in microbiology，2018，9：2870.

[5]Maisonneuve E， Shakespeare LJ， Jorgensen MG， et al. Bacterial persistence by RNA endonucleases [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（32）：13206 - 13211.

[6]Conlon BP， Nakayasu ES， Fleck LE， et al. Activated ClpP kills persisters and eradicates a chronic biofilm infection [J]. Nature， 2013， 503（7476）： 365 - 370.

（遼寧師范大學生命科學學院）