海南油茶葉片解剖結構與耐熱性比較

陳萍，王篤雄，羅健，張健，葉天文，袁德義

1.中南林業科技大學 經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室，湖南長沙 410004；

2.澄邁樂香種苗管理有限公司，海南澄邁 571900；

3.信陽農林學院園藝學院，河南信陽 465200

油茶是中國特有的木本油料樹種，也是海南島的傳統植物資源，海南島特有的氣候環境條件孕育了豐富而具有特色的油茶資源[1-2]。海南種植油茶歷史悠久，品質優良，所產茶籽油的口感與品質有別于內地，茶油具有獨特的香味，在當地被稱為“山柚油”[3-5]，價格較為昂貴。

葉片是植物進行光合作用、呼吸作用和水分交換最主要的器官，對溫度、水分、光照等環境因子的反應較為明顯[6-7]。一般認為，耐熱性較強的植物種具有較大的葉片厚度、柵欄組織厚度、柵海比以及較大的氣孔密度，并且關于植物葉片解剖結構與高溫脅迫的研究已在杜鵑（Rhododendron simsii Planch）、珙桐（Davidia involucrata Baill）、報春（Primula malacoides Franch）等植物中有相關報道。張騰駒[8]等，采用石蠟切片法、NaCIO 法觀察，結果表明珙桐種群植物葉片耐熱性主要有柵海比、柵欄組織厚度、氣孔密度、下表皮角質厚度、主脈凸起度、上表皮角質層厚度、下表皮細胞厚度等指標；申惠翡等[9]等對杜鵑花通過對葉片電鏡掃描對15 個品種葉片的17 項解剖結構研究，利用變異系數、相關分析和聚類分析對杜鵑花葉片解剖結構與其植株耐熱性的關系。曾慧敏等[10]研究了28 個八仙花（Hydrangea macrophylla）品種葉片的解剖結構指標進行觀察，通過聚類分析及隸屬函數的方法研究了八仙花葉片解剖結構與其耐旱性的關系。

有研究表明油茶在0℃以下的長期寒冷，或35℃以上的高溫，都會對油茶花造成凍害、灼傷、落花落蕾、花芽無法正常分化。油茶在最高月平均氣溫為31.0℃，絕對最高氣溫42.0℃以上，生長便受到抑制，葉片萎靡，果實脫落，甚至死亡，會直接影響油茶的產量和質量[11]。課題組自承擔國家林業公益性行業科研專項以來，對海南油茶資源進行了深入調研，發現并收集了一批優質海南油茶資源。通過對收集的種質資源利用高接換冠技術嫁接后發現，不同無性系油茶的耐熱性不同，所反映出的生長變化也不同，所以通過探討油茶葉片組織結構與耐熱性的關系，并篩選出耐熱性強的種質資源，建立一套完備快捷的耐熱性評價指標體系是十分必要的基礎工作。因此，研究通過對高接換冠后的海南油茶優質資源的葉片解剖結構特征進行差異比較及相關性分析，將其耐熱能力進行綜合排序，以期為海南油茶種質資源良種選育和擴繁提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在海南省澄邁縣福山鎮的中南林業科技大學教學實習基地，地處19°56′45″N、109°45′56″E，屬熱帶季風氣候，長夏無冬，熱雨同季，年平均氣溫23.8℃。土壤為赤紅壤，pH 值為5.0～5.5，且富硒程度高，具備油茶栽培的優良環境[5，12]。

1.2 試驗材料

2017 年4 月在該基地應用高接換冠技術對10個海南油茶無性系進行高接換冠，接后2a 基本恢復樹勢，選取生長旺盛，樹冠豐滿，無病蟲害，株體大小、土壤和光照條件基本一致的植株采集葉片固定保存。

1.3 葉片組織結構觀察

采用石蠟切片法[13-14]，乙醇梯度脫水，浸蠟、包埋，Leica RM 切片，切片厚度8μm，番紅—固綠雙重染色，中性樹膠封片。在OLYMPUS-BX53 型顯微鏡及其成像系統下觀察、拍照，采用Image-Pro-plus 軟件測量其葉片厚度（Leaf thickness）、主脈厚度（MT）、上表皮角質層厚度（Cuticle thickness of upper epidermis）、下表皮角質層厚度（Cuticle thickness oflower epidermis）、角 質 層 厚 度（Stratum corneum thickness）、上表皮細胞厚度（Thickness of upper epidermis）、下表皮細胞厚度（Thickness of lower epidermis）、柵欄組織厚度（Thickness of palisade tissue）與海綿組織厚度（Thickness of snoopy tissue），計算柵/ 海（P/S）=柵欄組織厚度（TP）/海綿組織厚度（TS）；組織結構緊密度（Tightness of leaf structure）=柵欄組織厚度（TP）/葉片厚度（LT）×100%；組織結構疏松度（Looseness of leaf structure）=海綿組織厚度（TS）/葉片厚度（LT）×100%，變異系數（CV）=（標準差/平均值）×100%[15-16]。每1 植株觀察10 張切片，每個制片選3 個視野進行測量，所有數據為30 個視野的平均值。

1.4 氣孔觀察

采用無色透明的指甲油印跡法制片[17-18]，進行氣孔密度測定；在OLYMPUS-BX53 型顯微鏡及其成像系統下觀察、拍照，采用Image-Pro-plus 軟件測量氣孔長度（Stoma length）及氣孔密度（Stoma density）。每個材料觀測5 個典型視野中氣孔，并求其平均值。

1.5 數據分析

采用Excel 2016 進行數據統計，運用SPSS 21.0 進行單因素方差、差異顯著性（P＜0.05）及線性相關關系分析。利用模糊數學中的隸屬函數法綜合評價10 個海南油茶種質材料的耐熱性[19]。

式中：Ri2為每類中第i 類中各項指標的相關指數；n 為每類中的指標個數(i=1，2，3，…，n)；r 為每類中各項指標與同類其他指標的相關系數，指標的相關指數越大，典型性越強。

隸屬函數公式為：

式中：f(Xi)為某一種群某一項耐熱指標的隸屬函數值；Xi為該項耐熱指標觀測值；Xmax和Xmin分別為10 個種質資源內該項耐熱指標的最大值和最小值。

根據上述公式計算篩選出海南不同油茶資源葉片耐熱性解剖結構指標的平均隸屬度，以平均隸屬度評價油茶的耐熱性，平均隸屬度越大，耐熱性越強。同時，參照靳路真等[20]的方法，按照平均隸屬度將耐熱性分為耐熱類型（R）、中耐熱類型（MR）、低耐熱類型（LR）和不耐熱類型（S）。

2 結果與分析

2.1 葉片組織結構比較

2.1.1 葉片生長參數

如表1 所示，試驗選擇的10 份海南省本地油茶資源，由于生長環境不同，不同油茶資源的葉片形態表現出顯著差異（見表1）。MTP-61 的葉長、葉寬、葉面積干重均高于其它無性系，而QZCZ-4 的葉長、葉寬，葉面積干重最低。

表1 10 個海南油茶無性系葉片生長情況比較Tab.1 Comparison of leaf growth of 10 Camellia hainanica materials

2.1.2 葉片厚度比較

葉片厚度常作為植物耐熱性指標之一。葉片厚度越大，水分散失越慢，在炎熱的環境下可降低水分蒸騰速率，緩解高溫對葉片的傷害程度。由表2 可見，10 個海南油茶無性系葉片厚度在340.41μm～457.46μm 之間，平均葉片厚度為394.59μm，最厚葉片與最薄葉片相差117.05μm，變異系數為10.39%，存在極顯著差異（p＜0.01）。不同種質材料葉片厚度大小依次為：QZCZ-4＞TCPX-6＞MX-2＞TCPX-7 ＞CMWR-16 ＞BFC-CDL ＞CSC-1 ＞MTP-61 ＞CMJL-6＞QZCZ-3。

表2 10 個海南油茶無性系葉片表皮特征比較Tab.2 Comparison of epidermis characteristics of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.3 葉表皮特征比較

表皮是植物的保護組織，是植物抵御外界不良環境的屏障。葉表皮包括上表皮和下表皮。由圖1 可見，10 個海南油茶無性系葉片表皮均為單層細胞且呈長方形或者不規則扁長方形排列構成，上表皮細胞比下表皮細胞大，表皮外覆角質層，表皮無毛，表皮細胞垂周壁略呈波浪狀。而CMWR-16 中上表皮細胞為規則的扁長方形，排列緊密。由表2 可知，10 個海南油茶無性系的上表皮均厚于下表皮，差異均達到極顯著水平。上表皮厚度在25.67μm～45.50μm之間，最厚上表皮是最薄上表皮的1.78 倍，變異系數為18.14%和16.82%，存在極顯著差異（p＜0.01）。上表皮厚度和下表皮厚度分別在33.47μm ～20.75μm，其中CMWR-16 上表皮最薄，TCPX-6 最厚，其相應平均值為25.67μm 和45.50μm。下表皮細胞厚度最厚的是BFC-CDL，CSC-1 最薄，其平均值為24.56μm 和14.58μm，其中TCPX-7、TCPX-6，上表皮細胞垂周壁略呈波浪狀(圖1)；葉片的表皮細胞壁外覆有一層4.91μm～8.08μm 的上表皮角質層和1.79μm～3.87μm 的下表皮角質層，而這種角質層是一層不透水的脂肪性物質，起防止水分散失的作用，通常角質層厚度越大，表明其耐熱性越強。不同油茶種質品種角質層平均厚度為1.68μm，MX-2最厚，CSC-1 最薄，變異系數為42.57%

圖1 10 個海南油茶無性系葉片橫切Fig.1 Cross section of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.4 葉片的葉肉特征比較

植物葉片主要通過葉肉組織完成各種生理機能。葉肉組織主要包括柵欄組織和海綿組織，其分化程度可以間接反應植物對外界環境適應的強弱。由圖1 可知，海南油茶種質資源葉肉均有明顯的柵欄組織和海綿組織的分化，柵欄組織是由緊密的柱狀細胞排列，海綿組織主要由排列疏松的橢球和球型細胞形成。對葉肉組織觀察（圖1），10 個海南油茶無性系的葉肉組織解剖結構存在極顯著差異。不同種質資源的柵欄組織厚度的變化范圍為84.81μm～179.95μm，其中CMWR-16 最大(179.95μm)，CMJL-6最小（84.81μm）。葉片海綿組織厚度明顯大于柵欄組織，且排列較為疏松，其中，TCPX-6 的海綿組織厚度最大為226.87μm，MTP-61 最小為158.24μm。各種群間葉肉組織結構緊密度變化范圍為0.24～0.45，CMWR-16 最大，QZCZ-4 最小。

表3 10 個海南油茶無性系葉片解剖結構及氣孔比較Tab.3 Comparison of anatomical structure and stomata of 10 Camellia hainanica

2.1.5 葉片氣孔特征比較

氣孔是植物與外界進行氣體交換的孔道和控制蒸騰的結構。一般認為，植物葉片氣孔小且密度大的植物在炎熱條件下可降低水分損耗。由表3 可知，海南省油茶不同品種的葉片氣孔特征存在極顯著差異(P＜0．01)。10 個油茶品種葉片的氣孔長度在31.03μm ～42.82μm，最大的和最小的分別是MTP-61 和TCPX-7，其平均值為35.41μm 變異系數為10.73%；氣孔平均密度為128.50μm，CMJL-6 最大，MTP-61 最小，變異系數為18.58%。

圖2 10 個海南油茶無性系葉片下表皮氣孔顯微結構Fig.2 Stomatal microscopic images in leaf lower epidermis of 10 10 Camellia hainanica

2.1.6 主脈維管束特征比較

主脈維管束主要由機械組織、木質部、韌皮部構成。反映植物對環境中水分和營養條件的適應。各油茶品種的中脈結構如圖2 所示，且中脈厚度存在極顯著差異(P＜0.01，表3)。中脈厚度從CMJL-6 的478.84μm 到CMWR-16 的706.96μm，最厚中脈是最薄中脈的1.48 倍，變異系數為10.35%。

圖3 10 個海南油茶無性系葉片主脈橫切面Fig.3 Cross sections of leaf midrib of 10 Camellia hainanica

2.2 不同海南油茶耐熱性綜合評價

2.2.1 葉片耐熱性解剖結構指標篩選

對10 個海南油茶無性系葉片解剖結構進行聚類分析發現（圖4），14 項指標距離為10 的時候可分為4 類：第1 類包括8 項指標上表皮厚度、下表皮厚度、角質層厚度、柵海比、組織結構緊密度、組織結構疏松度、下表皮角質層厚度、氣孔長度；第2 類為海綿組織和柵欄組織厚度；上表皮角質層厚度、氣孔密度為第3 類；主脈厚度和葉片厚度為第4 類。

圖4 10 個無性系海南油茶葉片14 項指標的聚類分析Fig.4 Variable cluster analysis of 14 Indexes of 10 Camellia hainanica

表4 葉片結構指標的相關矩陣Tab.4 Correlative matrix of leaf structure parameters

2.2.2 不同油茶品種葉片耐熱性評價

根據各指標間相關性分析矩陣（表4）與上述聚類分析圖（圖4），對相關性的各指標與其耐熱性進行綜合性分析，可將其分為4 大類種抗熱性劃分為抗熱類型(R，0．550～1．000)有CMWR-16；中度抗熱類型（MR，0．500～0．549）有QZCZ-4、CMJL-6、；低抗熱類型（LR，0．450 ～0．499） 有BFC-CDL、MX-2；不熱類型（S0．400～0．449）TCPX-6、CSC-1、TCPX-7、MTP-61、QZCZ-3。

表5 10 個海南油茶耐熱性綜合評價Tab.5 Comprehensive evaluation of heat resistance of 10 Camellia hainanica

3 討論

植物葉片的耐熱性反應了植物葉片在光合作用、氣體交換以及蒸騰作用后一種特性，而葉片本身形態結構是在自身遺傳特性和不斷受自然選擇而適應環境的結果[21-22]。葉片作為植物體暴露于環境中最大的器官，是對自然界中的光照、水份、溫度等主要生態因子的變化較為直觀感應[23]。研究學者證明植物解剖結構中的耐熱性與葉片厚度、氣孔密度、組織結構疏松度、柵欄組織厚度、柵海組織比、上、下表皮角質層厚度、角質層厚度、組織結構疏松度等指標相關[10-12、24-25]；耐熱植物的特點之一就是柵欄組織厚度越緊密，海綿組織相對不發達[26]。研究發現耐熱性較強的葉片厚度和柵欄組織厚度都較大，發達的柵欄組織能夠增強植物的光合作用，也能將水分進行高效運輸。

10 個海南油茶無性系的耐熱性由強到弱排列為：CMWR-16＞QZCZ-4＞CMJL-6＞BFC-CDL＞MX-2＞TCPX-6 ＞CSC-1 ＞TCPX-7 ＞MTP-61 ＞QZCZ-3。CMWR-16 的耐熱性最強，其氣孔密度小，柵欄組織、海綿組織發達，葉片厚度大因此葉肉細胞間的側向接觸面積增加，增強了植物在水平方向上的運輸能力。同時，中度耐熱的CMJL-6 葉片表皮厚度低、組織結構疏松度較高，氣孔密度高，利于葉片內部水分利用；而耐熱性較差的QZCZ-3、MTP-61，其葉肉組織薄，氣孔密度小。但MTP-61 的氣孔最長，這可能是因為不同品種（系）在不同環境中采取的耐熱機制不同。結合葉片解剖結構發現，CSC-1 的上表皮角質層、氣孔密度大，說明其抗旱機制除了增加葉片角質層厚度及葉片中柵欄組織比例外，還包括控制氣孔大小和密度；油茶無性系葉片各項指標的大小順序并不一致，可見在研究耐熱性時，不能單憑某一項指標來進行評價［27］。結合海南省的亞熱帶季風氣候特征，為海南省種質資源的選育推廣栽培及今后選育耐熱性的種質資源提供參考。