基于轉錄組測序的細風輪花青素合成途徑及關鍵酶基因分析

趙歷強 單春苗 張聲祥 施圓圓 馬克龍 吳家文

（1. 安徽中醫(yī)藥大學研究生院，合肥 230012；2. 安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心、新安醫(yī)學教育部重點實驗室，合肥 230038；3. 安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，合肥 230012；4. 安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230012；5. 安徽省中醫(yī)藥科學院，合肥 230012）

細風輪（Clinopodium gracile（Benth.）Matsum）為唇形科（Labiatae）風輪菜屬（Clinopodium）植物，又名塔花、瘦風輪、野薄荷等，主要分布于廣西、福建、廣東、貴州、四川等省份。細風輪的主要化學成分為三萜及其皂苷、黃酮、揮發(fā)油、苯丙素類、甾體等［1］。細風輪具有清熱、解毒、活血的作用，臨床上主要用于治療白喉、咽喉腫痛、乳腺炎和過敏性皮炎等［2］疾病。

近年來已經(jīng)成功從細風輪中分離出來黃酮、類黃酮和皂苷等化合物［3］。類黃酮化合物在人體內可表現(xiàn)出明顯的生物活性，例如清除自由基、抗菌、抗?jié)儭⑾住⒖垢咧Y、降血壓及抗癌、抗病毒［4～7］等。類黃酮化合物中的花青素（Anthocyanidin）是一種天然的抗氧化劑，在藍莓［8］、枸杞［9］和葡萄［10］等植物中含量較高，其在人體中能夠起到抗氧化［11］、降血脂［12］、消除炎癥［13］以及抗腫瘤［14］等作用。田野等［15］發(fā)現(xiàn)了紫嫣茶中的花青素具有抗結腸癌和乳腺癌的作用；劉麗敏等［16］報道了越橘中花青素能起到維護眼球健康、降低近視發(fā)生率的作用。

花青素是苯丙氨酸通過一系列的酶促反應后進一步經(jīng)過酰基化、甲基化、糖基化等修飾而生成，其儲存在植物的液泡中［17］。DFR（二氫黃酮醇還原酶）是參與花青素生物合成的限速酶［18］，可以催化二氫黃酮醇生成花色素［19］，大量研究表明DFR 在花青素的生物合成中起到了重要的調控作用［20～22］。

高通量測序技術可以在沒有參考基因組的情況下對中草藥轉錄組進行全面分析，確定其轉錄本 和 功 能 基 因 序 列［23～25］。目 前 黑 果 枸 杞［26］、麻黃［27］、紫背天癸［28］等中藥已經(jīng)完成了其轉錄組數(shù)據(jù)庫的構建，并對花青素生物合成途徑進行了研究，但目前尚未有細風輪花青素生物合成途徑研究的報道。本研究以細風輪花、葉、莖、根4個組織為樣品，首次采用高通量測序技術對細風輪進行轉錄組分析，從基因水平分析細風輪藥用活性成分花青素的生物合成途徑，為將來利用基因工程或代謝工程技術提高花青素的產(chǎn)量、進一步開發(fā)利用花青素奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用細風輪植株采集于安徽中醫(yī)藥大學的藥物園，由安徽中醫(yī)藥大學藥用植物分類學老師楊青山鑒定。新鮮的細風輪植株洗凈后，分離根、莖、葉、花各器官，用滅菌蒸餾水多次沖洗后濾紙擦干，分別收集放入50 mL 的離心管中，并迅速置于液氮中凍存［29］。

1.2 細風輪總RNA的提取

將所需器具高溫滅菌后，把細風輪的組織分別放入研缽中，邊加液氮邊研磨，粉末充分混勻后放入離心管中，離心后取上清液，用RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）對RNA 進行純化，用Agilent 2100 生物分析儀檢測其濃度及完整性后利用BGISEQ-500 平臺進行轉錄組測序。

1.3 數(shù)據(jù)過濾及組裝

將轉錄組測序所得到的原始讀序（raw reads）進行數(shù)據(jù)過濾，去除低質量、未知堿基N 含量大于5%和包含接頭的讀序（reads）后得到干凈讀序（clean reads）。使用Trinity 軟件對干凈讀序進行重頭組裝，然后使用Tgicl 將組裝的轉錄本進行聚類去冗余，最后得到Unigene。

1.4 Unigene的分類及注釋

利用NCBI Blastx 軟件將Unigene 分別注釋到NT（非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫）、KOG（NCBI 直系同源家族蛋白數(shù)據(jù)庫）、NR（NCBI非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫）、SwissProt（高質量非冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫）、KEGG（京都基因和基因組百科全書）以及GO（基因本位論數(shù)據(jù)庫）和Pfam（多序列比對和隱馬爾科夫模型構建的蛋白家族數(shù)據(jù)庫）。

1.5 結構特征分析

利用軟件Translate tool 確定細風輪DFR 的開放讀碼框（ORF）序列，利用MEGA 5 軟件和CLUSTALX 1.83 軟件對篩選出的DFR 的氨基酸序列進行比對，尋找其保守的活性位點并構建其系統(tǒng) 發(fā) 育 進 化 樹，最 后 采 用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）模擬出DFR的三級結構，再利用Pymol軟件描繪出其三級結構［30］。

2 結果和分析

2.1 細風輪總代謝和次生代謝概述

本研究利用BGISEQ-500 平臺一共測了43.81 Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)過從頭組裝后得到128 856個Unigene，利用Mapman 軟件對細風輪FPKM（Fragments per Kilobase Million）值大于1 的Unigene 在總代謝和次生代謝途徑中進行富集，發(fā)現(xiàn)在總代謝中基因主要富集在脂質、核苷酸代謝途徑（見圖1）；而在次生代謝中基因則主要富集在黃酮、木質素木酚素以及苯丙素類代謝途徑（見圖2）。

圖2 細風輪中FPKM＞1的Unigene在次生代謝中的富集及表達水平Fig.2 Enrichment and expression level of unigenes（FPKM＞1）from C.gracilein secondary metabolism

圖1 細風輪中FPKM＞1的Unigene在總代謝中的富集及表達水平Fig.1 Enrichment and expression level of unigenes（FPKM＞1）from C.gracile in total metabolism

2.2 細風輪中次生代謝途徑概述

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫分析，我們對細風輪可能參與各種代謝途徑的Unigene 進行了統(tǒng)計，結果表明2 312 個Unigene 參與了次生代謝產(chǎn)物的生物合成，包括14 個代謝途徑（見表1），其中苯丙素生物合成途徑（ko00940）含1 406 個Unigene，類黃酮生物合成途徑（ko00941）含455 個Unigene，吲哚生物堿生物合成途徑（ko00901）含187個Unigene，花青素的生物合成途徑（ko00942）含72 個Unigene。

表1 參與細風輪次生代謝途徑的Unigene數(shù)目Table 1 Number of unigenes involved in secondary metabolism pathways in C.gracile

表2 花青素合成關鍵酶Table 2 Key enzymes for the anthocyanin

2.3 鑒定與花青素生物合成相關的Unigene

通過分析細風輪轉錄組數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)了6 個與花青素生物合成相關的酶（見表2），分別由不同數(shù)目的Unigene 編碼。二氫黃酮醇還原酶（bifunctional dihydroflavonol 4-reductase，DFR）由7個unigene 編碼、黃烷酮3 羥化酶（flavanone-3-dioxygenas，F(xiàn)3H）由7個Unigene編碼、黃烷酮合成酶（chalcone synthase，CHS）由5 個Unigene 編碼、苯 丙 氨 酸 解 氨 酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）由7 個Unigene編碼、4-香豆酰輔酶A 連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）由10 個Unigene 編碼、查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）由4個Unigene編碼。

圖3 細風輪生物合成代謝的途徑分類Figure 3 Pathway classifications for biosynthesis metabolism in C.gracile

PAL 是花青素合成起始階段的關鍵酶，催化苯丙氨酸生成反式肉桂酸，4CL催化4-香豆酰生成香豆酰CoA，CHS催化4-香豆酰CoA生成柚皮素查爾酮，CHI 催化柚皮素查爾酮生成柚皮素，F(xiàn)3H 則催化柚皮素生成二氫山萘酚，DFR 催化二氫山萘酚生成白天竺葵苷元。苯丙氨酸經(jīng)過這一系列酶促反應最終生成了3種類型花青素即天竺葵色素、花翠素和矢車菊素。在細分輪花青素的生物合成途徑中，DFR 基因在葉和花中的表達量明顯高于根和莖，PAL 和F3H 基因在根和莖中的表達量明顯高于葉和花，而CHI 基因主要在花中高表達（見圖4）。

圖4 花青素生物合成途徑及關鍵酶在組織中表達水平分析聚類熱圖中列F、L、R、S分別表示花、葉、根、莖；行表示Unigene；顏色表示表達水平Fig.4 Anthocyanin biosynthesis pathway and Cluster heat map of the expression of key enzymes in tissuesF，L，R and S represent flower，leaf，root，and stem samples，respectively.Red and green represent high and low expression levels，respectively

2.4 細風輪花青素生物合成中基因差異表達分析

將細風輪葉和花組織進行比較，參與花青素生物合成的Unigene 有41 個差異表達，其中18 個在葉中上調、23個在葉中下調；將細風輪葉和根組織進行比較，參與花青素生物合成的Unigene有49個差異表達，其中22 個在葉中上調，27 個在葉中下調；將細風輪莖和花組織進行比較，參與花青素生物合成的Unigene 有41 個差異表達，其中24 個在莖中上調，17個在莖中下調（見圖5）。

2.5 細風輪花青素生物合成相關Unigene 的GO分析

GO 分類（見圖6）顯示有69 個參與花青素生物合成的Unigene 被成功注釋，并將其分為21 類，其中有9 個Unigene 參與“代謝過程”、9 個Unigene與“催化活性”相關、8 個Unigene 具有“氧化還原酶”活性、8個Unigene具“結合金屬離子”特性。

2.6 參與花青素生物合成的苯丙氨酸解氨酶結構特征

圖5 細分輪4個組織中參與花青素生物合成的Unigene差異基因表達A. 在細分輪4種組織中表達的Unigenes聚類熱圖；B. 細分輪兩兩組織比較基因表達上調和下調的數(shù)目Fig.5 Differential gene expression of anthocyanin in four tissuesA.Heatmap of unigenes of C.gracile involved in anthocyanin biosynthesis；B.The number of unigenes up-regulated or down-regulated in the specified samples are shown

圖6 細分輪花青素生物合成相關的Unigene GO富集Fig.6 GO enrichment of unigenes involved in anthocyanin biosynthesis in C.gracile

二氫黃酮醇還原酶（DFR）是類黃酮生物合成途徑的關鍵酶，催化二羥基黃酮醇轉變?yōu)榛ㄉ兀蛄斜葘Ψ治霰砻骷氾L輪中編碼DFR 酶的序列同源性較高，其中CL3369-1 與CL3369-2 這兩條氨基酸序列一致性達87.86%，它們通過Swiss-Model 構建的空間結構也非常相似。我們選擇與模板蛋白同源性最高的DFR（CL-3369-1）描繪其二級結構和空間結構。DFR 二級結構主要由α-螺旋和β-折疊構成，共含有15 個α-螺旋，11 個β-折疊，α-螺旋包裹著β-折疊，另外還有4 個TT 結構和2 個η 結構（見圖7）。

DFR 的空間結構模型為同源二聚體，呈現(xiàn)為致密的球狀結構，DFR 酶的NAD+特異性結合位點位于第一個α-螺旋與第一個β-折疊之間的loop 區(qū)域V9-Y29（VTGGSGYIASFLISHLLERGY）（見圖7）。

2.7 DFR同源關系及系統(tǒng)進化樹分析

通過NCBI BLAST 比對不同物種間DFR 氨基酸序列（見表3），結果表明細風輪與一串紅、芝麻、風鈴木等植物的DFR 蛋白序列一致性均達到65%以上。DFR 系統(tǒng)進化樹顯示，在已知數(shù)據(jù)庫中細風輪與一串紅（Salvia splendens）遺傳距離最短，親緣關系最近，這與它們同屬于唇形科植物的是一致的（見圖8）。

圖7 細風輪DFR的二級結構和三級結構示意圖A～B.細風輪DFR的三級結構（B紫色區(qū)域為NAD+結合位點）；C.細輪DFR的二級結構（黑色下劃線顯示NAD+結合位點）Fig.7 The secondary structure and tertiary structure of DFR in C.gracileA.The tertiary structure of DFR in C.gracile with helices colored in red，strands colored in yellow；B.The purple region shows the binding site for NAD+；C.The secondary structure of DFR in C.gracile（The black underline shows the NAD+binding site）

圖8 細風輪DFR系統(tǒng)發(fā)育進化樹0.05表示遺傳距離；黑色三角突出顯示細風輪Fig.8 Phylogenetic analysis of DFR in C.gracile0.05 shows genetic distance；The black triangle highlights the C.gracile

表3 不同物種間DFR比對結果Table 3 Homologous alignment of DFR protein

3 討論

本研究利用BGISEQ-500 平臺對細風輪花、葉、莖、根四個組織進行了轉錄組分析。利用Mapman軟件發(fā)現(xiàn)FPKM＞1的Unigene主要富集在總代謝中的脂質、細胞壁代謝以及次生代謝中的黃酮、苯丙素類代謝途徑。KEGG 分析表明，有2 312 個Unigene參與到次生代謝通路的14條途徑中，其中主要的代謝途徑是苯丙素、黃酮和花青素代謝途徑。GO 分析顯示參與花青素生物合成的Unigene主要富集在“代謝過程”和“催化活性”兩類功能。

前人研究證明PAL、CHS、CHI、DFR、F3H 和4CL 均是花青素合成路徑中的關鍵酶，它們在控制花青素生物合成方面發(fā)揮重要作用［31～35］。虎娟等利用轉錄組測序技術從黑果枸杞果皮中鑒定出與花青素合成相關的關鍵基因CHS、CHI、DFR、F3′H（類黃酮3′羥化酶）、ANS（花青素合酶）和F3′5′H（類黃酮3′5′羥化酶），進一步對他們的核苷酸序列、蛋白質一級序列及空間結構特征進行了分析，并利用RT-PCR 技術克隆了這些酶基因，驗證了它們是真實存在的［28］；蔣會兵等通過轉錄組測序分析紫芽茶樹的PAL、CHS、ANS、和UFGT（類黃酮糖基轉移酶）基因在不同種類中的差異表達，認為它們可能是紫芽茶樹中花青素合成途徑的關鍵酶基因［36］；Liu 等通過對不同花色毛茛的轉錄組測序鑒定出其花青素合成關鍵酶及其在不同花色毛茛中的表達量，發(fā)現(xiàn)關鍵酶基因中的F3H、F3′H、3GT（類黃酮-3-O 糖苷轉移酶）、5GT（類黃酮-5-O 糖苷轉移酶）和FMT2（類黃酮-O-甲基轉移酶2基因）在顏色為紅色品種中高表達，而F3′5′H和3MAT（花色苷3-O-葡萄糖苷-6-O-丙二酰基轉移酶基因）在紫色品種中高表達［37］，說明不同花色毛茛中的高表達關鍵酶基因種類不同。

在細風輪花青素合成途徑中，40個Unigene編碼6 個關鍵酶（PAL、CHS、CHI、DFR、F3H、4CL），其中DFR 基因在葉和花的表達量明顯高于根和莖，CHS 和CHI 基因在花和根中的表達量高于葉和莖，而PAL 和F3H 基因主要在根和莖中高表達，4CL 在莖中表達最低。細風輪中花青素在各組織中的含量可能是這些關鍵基因協(xié)同作用的結果，具體哪些基因發(fā)揮最關鍵的作用，有待于我們進一步研究。

二氫黃酮醇還原酶（DFR）是花青素生物合成下游途徑中的第一個關鍵酶［20］，細風輪中DFR 酶是由7 個Unigene 編碼的，它們氨基酸序列的一致性為42.08%，我們選擇與蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（PDB）中已知結構的葡萄DFR 酶（3bxx.1.A［38］）同源性最高的細風輪DFR 酶序列（編碼此酶的Unigene 編號為CL3369-1）構建其空間結構，發(fā)現(xiàn)DFR 酶二級結構主要由α-螺旋和β-折疊構成，α-螺旋包裹著β-折疊形成致密的“夾心餅干”樣結構，NAD+特異性結合位點位于第一個α-螺旋與第一個β-折疊之間的loop 區(qū)域，在植物中有高度的保守性。目前，有研究表明在花青素的生物合成中DFR 既是誘導酶［39］，又是限速酶［40］，在紅葉山茶、葉菜型甘薯和花生等植物中DFR 活性增加，花青素含量也增加［41～43］。細風輪中的DFR 酶很可能在調控細風輪中花青素的合成與積累中也發(fā)揮重要作用。

本研究對細風輪轉錄組數(shù)據(jù)進行了深入挖掘，對細風輪花青素生物合成途徑進行了詳盡的分析，鑒定了花青素生物合成中關鍵酶基因，為細風輪花青素生物合成途徑關鍵酶基因的克隆及其結構和功能的進一步研究提供了依據(jù)，也為將來花青素生物合成途徑的解析及調控機制的研究奠定了基礎。