澳洲堅果MiMYB2基因克隆及結構與功能分析

王文林 陳海生* 鄭樹芳 樊松樂 王立豐 譚秋錦覃振師 黃錫云 賀 鵬 湯秀華 許 鵬

（1. 廣西南亞熱帶農業科學研究所，龍州 532400；2. 海南大學熱帶作物學院，海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口570228；3. 農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室；省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室；農業農村部儋州熱帶作物科學觀測實驗站；中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海口 571101）

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）是一種原產于澳大利亞的常綠喬木果樹，其果仁含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質、氨基酸、可溶性糖、膳食纖維和礦物質等營養成分，具有藥用和保健等功能［1］。澳洲堅果果仁可加工成飲品、食品和果油等［2-3］。澳洲堅果副產品，比如果殼可用于制備活性炭［4］和吸附劑［5］，油粕可用于生產動物飼料［1］和多肽［6］等，經加工后可提高其經濟附加值。我國澳洲堅果品種主要是經過試種馴化的國外優良品種。國外優良品種在我國試種期間，經常面臨產量及品質降低的問題［7］。這是由于我國澳洲堅果主要種植地域分布在廣西、云南、貴州和四川，隨著環境的變化，各種病蟲害如花疫病、枝枯病、炭疽病、蚜蟲和蛾類等［8］，干旱［9］、磷［10］、低溫［11］等不可預測的非生物脅迫和生物脅迫對澳洲堅果的生長發育、品質和產量均有影響，制約了其產業的發展。

MYB轉錄因子是一個植物轉錄因子家族。其中MYB 家族成員R2R3-MYBs 參與了多種生物過程，包括生長發育、激素信號轉導、代謝、生物脅迫和非生物脅迫等。例如，AtMYB77 和ARF7 相互作用參與擬南芥生長素的信號轉導［12］。AtMYB32參與擬南芥花粉正常的發育［13］。楊樹MYB165 和MYB194屬于R2R3-MYB家族，啟動子激活實驗表明MYB194 和MYB165 抑制原花青素生物合成相關基因啟動子激活，過表達MYB165 和MYB194 轉基因楊樹導致葉片花青素積累減少，根系原花青素含量降低［14］。R2R3-MYB 家族轉錄因子成員AtMYB102 對 昆 蟲 草 食 動 物 菜 青 蟲 有 抗 性［15］。PbrMYB21 在耐旱性方面發揮著積極的作用［16］。迄今，澳洲堅果轉錄調控方面的研究和MYB 家族轉錄因子成員的結構與功能信息研究尚屬空白。研究R2R3-MYB 家族成員的結構與功能為闡明澳洲堅果抗逆機制和提高澳洲堅果品質和產量，促進產業發展具有重要意義。本研究從“桂熱一號”品種的葉片中克隆MiMYB2 基因，利用生物信息學對其結構和功能進行分析。澳洲堅果R2R3-MYB 家族轉錄因子成員的結構和功能的深入研究，將為闡明澳洲堅果生長發育和產量形成機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料“桂熱一號”和“695”品種由廣西南亞熱帶農業科學研究所澳洲堅果種質圃（E106.79.84，N22.14.34）提 供。“桂 熱 一 號”和“695”澳洲堅果品種嫁接苗種植于廣西南亞熱帶農業科學研究所中，2019 年3 月選取2008 年嫁接種植，樹齡為11 年兩品種澳洲堅果成年樹健康植株的枝條、花、葉為材料進行轉錄組分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取總RNA和cDNA的合成

按照總RNA 提取試劑盒提供的說明書，提取澳洲堅果“桂熱一號”品種葉片的總RNA，RNA 和反轉錄得到cDNA 的濃度與純度由Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析儀檢測（Gene Company Limited，上海）。按照TaKaRa 反轉錄試劑盒的說明書合成cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 克隆MiMYB2基因全長

根據澳洲堅果轉錄組測序序列，利用primer primer 6.0 軟 件 設 計 引 物MiMYB2F，5′-CGGTCCTTCTCAGTTTCTGC-3′，MiMYB2 R，5′-GCATCCTAACATCCCTGGAA-3′，引物序列由公司合成。以澳洲堅果“桂熱一號”品種正常葉片的cDNA 為模板，利用PCR 擴增MiMYB2 的全長序列，PCR 反應體系20.0 μL：69 μg·L-1cDNA 模板1.0 μL，2×EX-Taq PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃30 s，55℃50 s，72℃，80 s，32 個循環；72℃10 min。將PCR 產物加到0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，切割目的條帶后回收純化，目的片段連接pMD-18T 載體，16℃水浴 4 h 后，轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，恢復培養后均勻涂布在含羧芐抗性的培養基上，經PCR檢測后挑取陽性克隆測序。

1.2.3 MiMYB2生物信息學分析

利用在線分析工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、TMPred（https：//embnet.vitalit.ch/software/TMPRED_form.html）、SMART：Main page （http：//smart. embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）、PHYRE、PlantmPLoc2、PSIPRED V4.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和 MEME（http：//meme-suite. org/tools/meme）等對MiMYB2 進行生物信息學預測分析。利用Clustal Omega 在線工具軟件進行多序列比對。MEGAX 軟件構建系統進化樹（neighbor-joining，bootstrap 值設為1 000）。用于系統進化分析的擬南芥和其他物種的蛋白序列均下載自NCBI。

2 結果與分析

2.1 MiMYB2基因克隆

按照試劑盒操作方法提取澳洲堅果“桂熱一號”品種葉片的總RNA，從圖1 可見RNA 28S，18S和5S 條帶清晰完整且沒有發生降解（見圖1A）。以cDNA 為模板，采用PCR 擴增目的基因，結果如圖1B 所示，擴增出了與預期大小相符的特異性條帶。以澳洲堅果“桂熱一號”品種正常葉片的cDNA 為模板，利用PCR 技術克隆得到MiMYB2 cDNA 基因全長，測序驗證后，將cDNA 序列命名為MiMYB2。將MiMYB2 基因序列上傳至NCBI 數據庫，GenBank 登陸號為MN254976，MiMYB2 基因的cDNA 全長序列1 210 bp，包含1 002 bp 的開放閱讀框（ORF）如圖2 下劃線標記序列，編碼333 個氨基酸。

圖1 澳洲堅果桂熱一號RNA檢測及基因克隆結果A.RNA電泳圖；B.MiMYB2基因PCR擴增結果（M.Marker DL2000；1. 目的基因擴增產物）Fig.1 Total RNA of M.ntegrifolia（GUIRE1）and the PCR amplification products of MiMYB2 geneA. Total RNA of M. integrifolia（GUIRE1）；B. The PCR amplification products of MiMYB2 gene. M：Marker DL200；1. The objective gene amplification products

2.2 MiMYB2蛋白質的理化性質預測

利用ProtParam 工具在線分析MiMYB2 蛋白質的理化性質：分子式C1556H2477N447O511S19，總原子數5 010，分子量為36.231 61 kDa，等電點5.70，帶負電荷殘基總數（Asp+Glu）為42，帶正電殘基總數（Arg+Lys）為37，不穩定系數為67.68（該蛋白屬于不穩定蛋白），脂肪族氨基酸指數是67.09，總平均親水性為-0.507，推測MiMYB2蛋白是一個不穩定的親水蛋白。

2.3 MiMYB2蛋白質的磷酸化位點、跨膜結構及亞細胞定位預測

圖2 MiMYB2基因測序結果Fig.2 Sequence result of MiMYB2 gene

圖3 MiMYB2蛋白的磷酸化位點和跨膜結構預測結果A.MiMYB2蛋白的磷酸化位點預測結果；B.MiMYB2跨膜結構預測Fig.3 Prediction of phosphorylation sites and transmembrane structures of MiMYB2 proteinA.Prediction of phosphorylation site of MiMYB2 protein；B.Prediction of transmembrane domain of MiMYB2

利用NetPhos 3.1 在線分析工具預測MiMYB2蛋白磷酸化位點，結果表明，MiMYB2 氨基酸序列有可能發生磷酸化的氨基酸位點共有53 個，絲氨酸磷酸化位點44個，蘇氨酸磷酸化位點7個，酪氨酸磷酸位點2 個（見圖3A）。根據MiMYB2 蛋白磷酸化位點預測結果，推測MiMYB2 蛋白以絲氨酸為主的磷酸化修飾，調控澳洲堅果的生物功能。利用TMPred 在線工具分析預測MiMYB2 跨膜結構，結果表明MiMYB2 蛋白無跨膜結構，推測Mi-MYB2 是非跨膜蛋白。利用SignalP-5.0 Server 分析預測MiMYB2 蛋白存在信號肽的概率為0.09%（見圖3B），推測MiMYB2 是非分泌型蛋白。利用PlantmPLoc2 預測分析MiMYB2 蛋白亞細胞定位，預測結果顯示其定位于細胞核中，其進一步證明MiMYB2 編碼一個轉錄因子蛋白。

2.4 MiMYB2 蛋白質保守結構域、二級結構、三級結構分析

利用SMART：Main page 分析預測MiMYB2 蛋白的保守結構域，發現其存在2 個SANT 結構域和5 個低復雜度其位置排序分別在13-63、66-114、128-143、168-179、214-226、235-246 和253-284 氨基酸處，MiMYB2 氨基酸序列具有兩個SANT 保守結構域（見圖4B），推測其屬于R2R3-MYB 家族。利用SOPMA 分析MiMYB2 蛋白的二級結構，結果顯示α 螺旋占37.54%，延長鏈占10.81%，β 折疊占6.31%，無規卷曲占45.35%（見圖4A）。利用PHYRE 分析MiMYB2 的三級結構如圖4C 所示。據此推測MiMYB2 是一個轉錄因子并且屬于R2R3-MYB家族成員。

圖4 MiMYB2結構分析A.MiMYB2二級結構預測；B.MiMYB2保守結構域預測；C.MiMYB2三級結構預測Fig.4 Structural analysis of MiMYB2A.PredictionforthesecondarystructureofMiMYB2；B.PredictionoftheconserveddomainsofMiMYB2；C.PredictionforthetertiarystructureofMiMYB2

2.5 MiMYB2系統進化分析

如圖5 所示，澳洲堅果MiMYB2（M.integrifolia，MN254975）與荷花NnMYB3-like（Nelumbo nucifera，XP_010255443.1）、荷花Nnmyb-related protein 308-like（Nelumbo nucifera，XP_010273102.1）、醉 蝶 花 ThMYB6（Tarenaya hassleriana，XP_010523735.1）、麻 風 樹JcMYB6（Jatropha curcas，XP_012083427.1）和哥倫比亞錦葵HuMYB41（Herrania umbratica，XP_021280626.1）進行同源性分析，相似性分別為64.79%，65.99%，59.88%，58.08%和56.18%，其與荷花NnMYB3-like 同源性最高。Clustal 進行多序列比對分析并根據圖4B分析的結果標注MiMYB2 保守結構域SANT（見圖5A）。利用MEME 分析澳洲堅果MiMYB2 與其在NCBI數據庫中比對親緣性較高的MYB蛋白序列，預測了排名前三的motif 且標注了其在相應序列的位置，如圖5B 所示澳洲堅果MiMYB2 a（77-126）、b（1-50）、c（339-367），同源性越高的序列，其motif 的大小及位置越接近。Motif 與植物的生物學功能息息相關。將MiMYB2 編碼的蛋白序列與BLAST 比對結果中相似性較高的已知其他植物的MYB 序列進行系統進化分析，表明MiMYB2 與荷花 NnMYB3-like （Nelumbo nucifera， XP_010255443.1）、荷花Nnmyb-related protein 308-like（Nelumbo nucifera，XP_010273102.1）親緣關系較近（見圖6A）。系統進化分析澳洲堅果MiMYB2與126個擬南芥R2R3-MYB家族成員的蛋白序列，如圖6B 結果顯示MiMYB2 與AtMYB17、AtMYB106、AtMYB91、AtMYB16 親緣關系較近，AtMYB17、At-MYB106、AtMYB16 屬于擬南芥S9 亞族［17］，推測MiMYB2具有與S9亞族成員相似的功能。

2.6 MiMYB2基因組織表達模式分析

為研究MiMYB2 基因在“桂熱一號”和“695”品種不同組織中的表達模式，本研究從“桂熱一號”和“695”品種澳洲堅果轉錄組數據中提取了MiMYB2基因在枝條、花、和葉片的表達數據，分析其在不同品種和不同組織的表達模式。如圖7 所示，“桂熱一號”品種，MiMYB2 主要在枝條和葉片中表達，花中的表達量較低，葉片中MiMYB2 基因表達量是花的8 倍左右；“695”品種中，MiMYB2 主要在花中表達，枝條和葉片中表達量較低，在花中的表達量是葉片的10 倍左右。“桂熱一號”和“695”品種同一組織MiMYB2 基因的表達在花和葉片中相差較大，特別是其在花中的表達量“695”是“桂熱一號”的13倍左右。

3 討論

圖6 澳洲堅果MiMYB2系統進化分析A. 植物中部分MYB轉錄因子的系統進化樹；B. 澳洲堅果MiMYB2蛋白與擬南芥中126 R2R3-MYB家族成員蛋白序列的系統樹聚類分析Fig.6 Phylogenetic analysis of M.integrifolia MiMYB2A. Phylogenetic tree of MiMYB2 and other plant MYB transcription factors；B. Phylogenetic tree of MiMYB2 from M. integrifolia and 126 R2R3-MYB protein members from Arabidopsis with indicated GenBank accession numbers

澳洲堅果果仁具有豐富的脂肪酸，趙大宣等采用氣相色譜、質譜聯用技術檢測到13 種脂肪酸成分，其中不飽和脂肪酸（油酸、異油酸、棕櫚酸）總量占了69.12%，飽和脂肪酸總量占30.87%，不飽和脂肪酸對冠心病、糖尿病等疾病具有效用［18］。楊為海等分析了不同種質澳洲堅果果仁礦質元素含量，研究發現果仁中含有多種常量和微量元素，如K、Mg、Mn、Fe 平均含量分別為3.87、1.85、95.91和90.58 mg·kg-1［19］。澳洲堅果果油含有生育酚、角鯊烯等多種抗氧化物質［1］。澳洲堅果青皮提取的多酚，以Trolox 為陽性對照評價其抗氧化性，研究發現其可用于制備天然抗氧化劑［20］。寧平等研究表明澳洲堅果果殼可用于制備活性炭。涂行浩等利用微波輻照澳洲堅果果殼制備的活性碳產品，其吸附性能超過國家一級標椎［4，21］。楊雯等以澳洲堅果果殼等為原料，利用超聲-7 堿組合技術制備的吸附劑可用于處理印染廢水［5］。澳洲堅果及其副產品具有較高的營養價值和經濟價值。我國澳洲堅果品種主要是經過試種馴化的國外優良品種，優良品種離開本土后其產量和品質均有下降，不可預測的生物和非生物脅影響著澳洲堅果的品質和產量。迄今，澳洲堅果的研究主要集中在栽培管理和雜交育種、誘變育種等，然而澳洲堅果如何調控高產優質的機制及抗逆機制尚不清楚且研究較少。分子標記育種技術結合雜交育種是選育澳洲堅果優良新品種的重要方法。宮麗丹等［22］研究澳洲堅果耗水規律及灌溉制度，結果表明不同時期合理灌溉可提高產量和品質。譚秋錦等［23］研究發現土壤養分因子（氮、鉀、pH、有機碳）對澳洲堅果果實的品質有影響，適當提高土壤氮、鉀含量合理控制施肥種類可以提高其品質。唐瑩瑩等［24］建立的澳洲堅果RAPD 標記反應體系可用于分析澳洲堅果遺傳多樣性及鑒定種質資源。孔廣紅等［25］利用Co-γ 射線輻照不同種質澳洲堅果種子，篩選出了4 株性狀優良的突變單株。Nock 等對廣泛種植的澳洲堅果品種741 的基因組和轉錄組進行了測序，將澳洲堅果測序結果與其他5 種真雙子葉植物的基因家族比較，發現了13 689 個含有澳洲堅果基因的簇和1 005 個澳洲堅果特異簇。通過對參與氰苷生物合成的澳洲堅果基因的分析，發現了幾個高表達的候選基因，為病原識別、植物防御和單萜合成中基因家族的功能研究打下了基礎［26］。Abubaker等［27］對埃及栽培的澳洲堅果進行了DNA 指紋圖譜分析，在DNA 指紋圖譜研究中記錄了16個不同的RAPD片段。

圖7 MiMYB2基因在不同品種和組織中的表達分析各柱形圖上用不同大寫字母標識表示數據間差異極顯著（P＜0.01）Fig.7 MiMYB2 expression in different cultivars and tissuesDifferent uppercase letters above each column means significant at P＜0.01 level

R2R3-MYB 家族轉錄因子成員與植物的生長發育、生物脅迫和非生物脅迫密切相關。研究澳洲堅果R2R3-MYB 家族成員的結構與功能，將為闡明澳洲堅果產量調控機制具有重要的意義。本研究通過PCR技術從澳洲堅果“桂熱一號”的葉片克隆了MiMYB2 基因，測序分析cDNA 序列全長為1 210 bp，推導的氨基酸序列為1 002 bp ORF，編碼333 個氨基酸。生物信息學分析發現，MiMYB2具有兩個SANT保守結構域，推測屬于屬于澳洲堅果R2R3-MYB 家族；MiMYB2 定位于細胞核是一個無跨膜結構、無信號肽的不穩定親水蛋白。

MiMYB2 蛋白序列提交到NCBI 數據庫進行BLAST 比對分析，結果表明其與荷花NnMYB3-like（Nelumbo nucifera，XP_010255443.1）同源性最高（見圖5A）。Deng 等對荷花（Nelumbo nucifera）中116個R2R3 MYB基因的基因結構、表達模式等進行分析，R2R3-MYB基因可分為4組并利用熒光定量PCR 分析了13 個與類黃酮生物合成相關的MYB 基因在荷花不同組織中的表達模式［28］。Sun等［29］利用酵母雙雜交試驗證明，NnMYB5 與Nnb-HLH1、NlbHLH1 和NnTTG1 相互作用，NnTTG1 也與NnbHLH1 和NlbHLH1 相互作用。在擬南芥中過表達NnMYB5 導致擬南芥未成熟種子和花梗中的花青素積累，TT19表達上調，證明NnMYB5是花青素合成的轉錄激活因子。Peng 等［30］對麻瘋樹MYB 家族的全基因組鑒定，鑒定了128 個MYB 基因包括123 R2R3-MYBs，4 R1R2R3-MYBs 和1 4RMYB，選取JcMYB2 基因進行功能研究，發現過表達JcMYB2 植物比野生型更耐鹽、耐冷脅迫。Mi-MYB2 氨基酸序列與126 個擬南芥R2R3-MYB 家族成員的系統進化分析表明，MiMYB2 與At-MYB17、AtMYB106、AtMYB91、AtMYB16親緣關系較近（見圖6B），AtMYB17、AtMYB106、AtMYB16屬于擬南芥S9 亞族，將MiMYB2 聚類為S9 亞族。R2R3-MYB 家族轉錄因子成員，AtMYB17 與早期花序發育和種子萌發相關［31］。成熟擬南芥表皮毛的轉錄譜分析表明，NOECK 編碼MIXTA-Like 轉錄調控因子MYB106 與細胞生長有關［32］。白樺中一種新的R2R3-MYB 轉錄因子BpMYB106 通過上調光合作用和氧化磷酸化途徑相關基因表達，提高光合作用和生長速率［33］。擬南芥R2R3-MYB 家族成員MYB16 和MYB106 在生殖器官、營養器官和表皮毛中調控角質層形成［34］。擬南芥S9 亞族成員主要與植物的生長發育相關。通過系統進化分 析 將MiMYB2 與AtMYB17、AtMYB106、At-MYB16 聚類為S9 亞族。分析“桂熱一號”和“695”品種澳洲堅果轉錄組數據中MiMYB2 基因在不同組織的表達模式。從圖7可知，“桂熱一號”中，Mi-MYB2 在花中的表達量最低，然而“695”中花中的表達量最高。花屬于植物的生殖器官，其形成與生長屬于生殖生長，成花的遲早接的影響了果樹的產量。Cao 等［35］通過熒光定量PCR 檢測了20 個可能參與木質素生物合成的PbMYB 基因的表達模式，推測PbMYB25 和PbMYB52 是梨果實發育過程中參與木質素合成調控的候選基因。蘋果MYB轉錄因子MdMYB3 參與花青素生物合成和花發育的轉錄調控，MdMYB39L 與花粉管生長相關［36-37］。在煙草中過表達桃子轉錄因子MYB10.1 導致了NtMYB305 的抑制，而NtMYB30 是花發育所必需的［38］。綜上，推測MiMYB2 參與調控澳洲堅果生長發育及產量形成機制，有待深入研究。