神經元型一氧化氮合酶在先天性肥厚性幽門狹窄犬幽門的表達

魏 穎 張又祥

廣州市第一人民醫院新生兒科(廣州 510180)

先天性肥厚性幽門狹窄(congenital hypertrophic pyloric stenosis,CHPS)又稱嬰兒肥厚性幽門狹窄(infantile hypertrophic pyloric stenosis,IHPS)，是一種以幽門環肌增生、肥厚為特征的需手術介入的消化道疾病。其病因及致病機制目前尚不清楚，建立成功的CHPS動物模型是研究CHPS的病因、致病機制與治療的很重要的方法。目前為止，國內外未見成功的CHPS動物模型。

有研究發現CHPS患兒幽門區存在nNOS陽性神經元減少，推測幽門區nNOS表達減少與CHPS可能相關[1]。也有文獻報道，幽門區nNOS mRNA表達下降及其基因多態性與CHPS密切相關[2]。既往有研究[3]證明NOS抑制劑L-NAME可引起新生鼠幽門環肌層肥厚。

本實驗選取Beagle孕犬通過腹腔注射L-NAME制作CHPS犬動物模型，觀察其新生犬生后的生長發育情況和幽門環肌層的厚度及幽門組織中nNOS的表達情況，探討nNOS與CHPS的關系，為進一步的CHPS的致病機制研究和干預治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4只成年Beagle孕犬，普通級，體質量在10～12 kg左右，均由廣州醫藥研究總院實驗動物研究開發中心提供。本次研究遵循國家有關實驗動物管理和使用的規定。

1.1.2 主要試劑及儀器 L-NAME(N-硝基—左旋精氨酸甲酯，N-nitro-L-arginine methylester hydrochloride，Sigma，美國)，小鼠抗nNOS單克隆抗體(BD，美國)，枸櫞酸鈉粉劑、PBS緩沖液粉劑、DAB顯色試劑盒均購自Solarbio公司，免疫組化染色SP試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，冰凍切片機(FSE型，Thermo，美國)，凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，恒溫烤箱(HH-BH- 420,上海躍進醫療器械廠)，顯微鏡(Leica，德國)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 將4只Beagle孕犬按3:1分為模型組和對照組，自孕期第1天至分娩前1天，模型組孕犬每天腹腔注射一次L-NAME 6 mg/(kg·d)，對照組給予同樣方式注射等量的生理鹽水。所有孕犬均飼喂用普通的自來水和飼料。

兩組新生犬生后母乳喂養，在生后第31天、38天、45天及52天分別稱重。

1.2.2 標本制作 生后52天時，從模型組選取體質量增長緩慢的新生犬和對照組新生犬各5只作為實驗對象，外科手術取幽門組織，行胃空腸吻合術后繼續喂養。幽門組織經中性福爾馬林固定后經常規脫水、透明、浸蠟和包埋后制成厚約4 μm的石蠟切片，每個幽門組織隨機取4張切片，第1張和第3張切片做常規HE染色，第2張和第4張切片做免疫組化。采用自身對照作陽性對照，PBS代替一抗和二抗作陰性對照。

1.3 結果判定

1.3.1 免疫組化結果判定方法nNOS主要表達于幽門環肌的腸肌神經叢細胞胞漿內，陽性標準為腸肌神經叢細胞胞漿可見黃色或棕黃色顆粒。顯微鏡下隨機選4個視野拍片(放大倍數40×10)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量分析，測定三項主要指標，陽性面積(Area)，積分光密度(IOD)，平均光密度(MD)。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組新生犬生長發育情況

對照組產5只新生犬，模型組產14只新生犬，所有新生犬均發育正常。模型組新生犬與對照組新生犬相比，體質量增長慢，差異有統計學意義(P<0.01)，模型組幽門環肌肥厚度大于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。(見表1、表2、圖A、圖B)

表1 兩組新生犬生后體質量變化情況

表2 正常組和模型組52日齡新生犬幽門環肌厚度比較

圖A 正常組52日齡新生犬幽門環肌厚度(6.3×10)

圖B 模型組52日齡新生犬幽門環肌厚度(6.3×10)

2.2 nNOS在兩組新生犬幽門的分布和定量分析

nNOS主要表達于幽門環肌與縱肌間的腸肌神經叢細胞內。與對照組新生犬相比，模型組新生犬幽門組織中nNOS表達減少(P<0.05)。(見表3,圖C、圖D)

圖C 對照組新生犬幽門肌間神經纖維中nNOS的表達(40×10)

圖D 模型組新生犬幽門肌間神經纖維中nNOS的表達(40×10)

表3 nNOS在對照組和模型組新生犬幽門的免疫組化圖像分析三項

3 討 論

CHPS是由于幽門環肌增生肥厚引起新生兒和嬰兒嘔吐的幽門梗阻性疾病。主要臨床表現為生后2～4周開始出現非膽汁性噴射性嘔吐，多于喂奶后半小時內出現，呈進行性加重，常伴隨有消瘦、脫水及電解質紊亂等臨床癥狀，體格檢查可見胃蠕動波，于右上腹觸及一橄欖狀、質較硬的可移動包塊，胃腸道B超可見幽門肌層增厚，幽門狹窄，幽門管形成，消化道X線鋇餐檢查可見幽門管狹長，胃排空延遲，可見典型的“雙肩征”、“線樣征”等本病特有的X線征象[4]。其病理學特征是幽門肌全層增生肥厚，尤其以幽門環肌細胞增生肥厚為主，肌纖維排列紊亂，黏膜充血、水腫。目前主要治療方式為幽門肌切開術，可直接解除幽門梗阻，且術后無長期功能及形態異常，復發率低。也可靜脈或口服阿托品治療，其優點是不需要手術，無創傷，但此方法治療時間較長，治療期間控制電解質紊亂難度大。其發病率在歐美國家為2.5‰～8.8‰,我國約為3‰，多見于男性[5]。其病因及致病機制尚不明確。目前認為,IHPS的發生可能與遺傳、胃腸激素、胃腸道神經發育異常等因素密切相關[6]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種內皮細胞來源的舒張因子，在調節幽門括約肌舒張中發揮作用[7]。其由底物左旋精氨酸(L-arginine,L-arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化作用下合成，NOS是其限速酶。目前已知，NOS有三種亞型，其中內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和nNOS是其兩種亞型，nNOS位于神經元細胞中，在機體內發揮著舒張血管、舒張平滑肌以及進行神經傳導等生理功能[8]。

胃的幽門處分布有密集NOS陽性神經元纖維[9]。有研究發現CHPS患兒幽門組織中的nNOS神經元數量減少，推測CHPS的發生可能與幽門部nNOS的表達減少相關[2]。也有文獻報道nNOS與CHPS發病密切相關[10]。

L-NAME主要抑制eNOS，有研究表明nNOS的活性可被高濃度L-NAME抑制，其可與L-arg競爭性結合NOS，抑制NOS的活性，減少NO的合成。

本實驗首先給予Beagle孕犬腹腔注射L-NAME,結果顯示，兩組新生犬生后均無肢體發育異常情況。表明腹腔注射L-NAME對新生犬的胚胎期發育無影響。

目前國內外有關IHPS動物模型的相關報道極少，且尚無模型建立成功的統一標準，主要依據臨床癥狀、體征及病理學檢查等。本實驗前期發現兩組新生犬生后30天內的體質量增長的比較，無差異，自生后31天始，兩組新生犬的體質量增長出現差異，我們連續觀察和記錄了3周兩組新生犬的體質量增長情況，并用顯微鏡觀察測量HE染色后的幽門環肌層厚度。模型組新生犬與對照組新生犬相比，幽門環肌層明顯增厚，且體質量增長緩慢。兩組間差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01)。推測其可能原因是孕犬腹腔注射L-NAME，L-NAME經胎盤進入新生犬體內，間接抑制新生犬胃腸道NOS陽性神經元內nNOS的活性，減少NO的合成釋放，繼而導致幽門肌層增生肥厚和幽門括約肌舒張功能障礙，使進入小腸的食物量減少，最終引起新生犬體質量增長緩慢。本實驗中，模型組新生犬雖無嘔吐、體質量不增或下降等CHPS臨床癥狀，但體質量增長明顯緩慢，病理組織學顯示幽門肌層明顯增生肥厚，尤其以幽門環肌為主，肌纖維排列紊亂，支持給予Beagle孕犬腹腔注射L-NAME可誘導建立類似CHPS犬模型。兩組新生犬幽門組織免疫組化結果顯示，nNOS主要表達于幽門環肌與縱肌間的腸肌神經叢細胞內。與對照組新生犬相比，模型組新生犬幽門組織中nNOS的表達明顯減少,兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。與趙煜等[1]研究相同，推測幽門區nNOS的表達減少與CHPS相關。

由于本實驗條件受限，我們僅在蛋白水平研究nNOS與CHPS的關系，隨著相關研究的深入，nNOS在CHPS的作用將得以進一步闡明。根據NO在胃腸道的生理作用機制，我們可研究使用NO的供體來提高CHPS患者幽門中NO的活性，為CHPS的臨床治療提供一種新的治療方法。