基于網絡藥理學預測銀杏葉治療心肌缺血的作用機制

謝 巍 楊 妮 肖 萍

柳州市婦幼保健院 (柳州 545001)

心肌缺血(Myocardial Ischemia)是指心臟血液灌注減少、供氧降低，導致能量代謝異常，無法支持心臟正常工作的一種病理狀態[1]。血壓降低、冠狀動脈阻塞、炎癥、心瓣膜病、血黏度變化、心肌病變均會引發心機缺血。西醫臨床上對心肌缺血的治療重在改善供血、降低耗氧、提高心肌組織對低氧的耐受性[2- 3]。目前, 我們國家心腦血管疾病的發病率、病死率與日俱增, 心肌缺血已經演變成人類健康的頭號殺手。中醫將該病歸屬于“胸痹”范疇[4]。其主要病機為心脈痹阻，具有擴張血管類中藥常用于心肌缺血的治療。因此，探討銀杏葉治療心肌缺血作用機制具有一定的應用價值。

銀杏葉，為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉，味甘、苦、澀，平，歸心、肺經，具有斂肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效，主要用于用于肺虛咳喘；冠心病，心絞痛，高血脂等疾病。其主要的化學成分銀杏葉主要有黃酮、萜內酯、酚酸, 聚異戊烯醇等。其中黃酮、萜內酯和聚異戊烯醇是銀杏葉發揮獨特藥理活性的有效成分[5- 6]。現代藥理研究表明，銀杏葉具有擴血管作用、抗凝、清除體內自由基、抗心肌缺血、再灌注損傷的作用[7]，銀杏葉可能通過產生自由基產生延緩心肌功能及代謝的恢復、觸發許多突發的代謝、電生理、形態學及功能性的改變治療心肌缺血[8- 9]。但是，中藥發揮療效具有多成分、多靶點的特點，因此銀杏葉抗心肌缺血機制是多途徑的，目前對銀杏葉發揮抗心肌缺血的藥效成分及作用機制尚缺乏整體認識。

網絡藥理學是基于系統生物學和多向藥理學的方法，通過構建生物分子網絡從相互聯系的角度研究問題，結合整體層面及分子網絡層面為研究中藥治療疾病的分子機制提供了全面有效的方法[10-11]。將疾病的治療策略從單靶點、單藥轉變為多靶點、多組分，與中藥治療疾病“整體性、多靶點”的特點契合。本文基于網絡藥理學方法構建銀杏葉“成分-靶點-通路”網絡，分析其治療心肌缺血疾病的作用機制，尋找關鍵作用分子和信號通路，為進一步實驗研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉活性成分及其作用靶點的篩選

利用TCMSP數據庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索銀杏葉中的化學成分，再篩選口服生物利用度(oral bioavailability)OB≥30%和類藥性指數(drug like index)DL ≥ 0.18[12]的有效成分。進一步利用該平臺查詢化合物對應靶點，并將已篩選出的靶蛋白名轉換為swiss-port ID和靶點簡稱，進行標準化。

1.2 心肌缺血的相關疾病靶基因收集

利用GeneCards數據平臺(https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/)和OMIM數據平臺https：//www.omim.org/)，檢索“心肌缺血”的相關靶基因，Uniprot 標準化基因信息，并剔除無人類樣本Uniprot ID的基因。

1.3 基因映射

將化合物靶點和疾病靶點信息進行基因映射，獲取化合物-疾病共同作用靶基因，并用R軟件繪制Venn圖，確定共同作用的靶基因。

1.4 PPI網絡的構建

將銀杏葉—心肌缺血共同作用靶點的基因上傳至在線STRING平臺(https：//string db.org/) 構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡模型，蛋白種屬設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為中等“medium confidence”(>0.4)，其他參數保持默認設置，獲得PPI網絡。

1.5 網絡構建及分析

用Cytoscape 軟件(v3.6.0) 構建“化合物—靶點—通路—疾病”網絡圖，并計算網絡拓撲參數，將前20 位的信號通路與富集在該通路中的蛋白構建“靶點-通路”可視化網絡。網絡中一個節點的度表示與該節點直接相互作用的節點的數目，度值越大則表示該節點參與的生物功能越多，在網絡中的重要性越大。

1.6 GO 功能富集分析及 KEGG通路富集分析

應用R軟件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等安裝包進行GO 功能富集分析及 KEGG通路富集分析，對所預測的化學成分靶點進行富集分析，保留P≤0.05的結果，然后進行可視化處理，分析銀杏葉治療心肌缺血可能的生物過程和信號通路，最終分別繪制GO和KEGG富集分析的氣泡圖和通路圖。

2 結 果

2.1 銀杏葉潛在藥效成分與靶點篩選

通過 TCMSP 共收集到銀杏葉活性化合物307個，以 OB≥30%和 DL≥0.18 篩選高活性化合物27個，收集化合物的作用靶點2 164個。以自由度(Degree) 值表示預測出該成分與作用靶點的關聯個數，度值的大小即代表著在網絡中的關鍵度。見表1。共篩選525個作用靶點，見表1，分子MOL000098(槲皮素，quercetin) 的作用靶點最多(degree=145), 接著是分子MOL000422(山柰酚，kaempferol)(degree =63)，和分子MOL000006(毛地黃黃酮，luteolin)(degree=57) 等。這些活性成分具有較多的作用靶點，可能在銀杏葉的藥理功能中起到較為核心的作用。在27個活性成分中有15個成分有10以上的靶點，說明銀杏葉中含有的這些活性成分可能共同作用于整個生物網絡系統，而非單一靶點，一定程度說明中藥所具有的多成分、多靶點的復雜性。

表1 銀杏葉篩選后得到的27個活性成分

2.2 “銀杏葉—心肌缺血靶點”共同靶點的篩選

靶點是藥物與機體大分子之間的結合位點也是在藥物和疾病之間最重要的銜接環節。在現代藥物的研究和開發中，尋找和篩選藥物最準確的靶點對確定藥物的治療方向以及保證藥物的療效具有重要意義。本研究檢索 GeneCards和OMIM數據庫，共獲得類心肌缺血相關的疾病靶點531個，將這531個疾病靶點與463個銀杏葉化學成分的作用靶點，采用R軟件VennDiagram安裝包繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得疾病-類藥活性成分共同靶點40，這些靶點在銀杏葉治療心肌缺血中有重要意義的靶點。結果見圖1。

圖1 心肌缺血靶點與銀杏葉有效成分靶點韋恩

2.3 “活性成分—作用靶點——相關疾病”網絡模型構建

運用Cytoscape 軟件將獲得的疾病-類藥活性成分40個共同靶點與活性成分和疾病構建網絡模型。見圖2。銀杏葉的17種藥效成分協同作用于40個心機缺血靶點，與槲皮素(quercetin)對應的靶點最多，其次為山奈酚(kaempferol)，毛地黃黃酮(luteolin)，異鼠李亭(isorhamnetin)說明銀杏葉中槲皮素、山奈酚、毛地黃黃酮和異鼠李亭可能在治療心肌缺血過程中起到關鍵作用，同時復雜的網絡模型體現了中藥的作用是多成分、多靶點協同作用的結果。

長方形代表中藥銀杏葉，菱形代表黃其中有效成分，尖叫四邊形代表靶基因，大橢圓形代表心肌缺血疾病圖2 “活性成分-作用靶點-相關疾病”網絡模型

2.4 “銀杏葉—心肌缺血靶點”蛋白互作(PPI)網絡分析

通過在線 STRING 平臺，設置medium confidence 選擇大于0.4, 隱藏游離的點，獲得 PPI 網絡。該網絡包括 39個節點，248條連線，每一條連線表示有一種證據證明兩個蛋白有互作關系，每一個節點表示一個蛋白，節點的顏色表示不同的連接證據，節點自由度的大小表示在網絡中的重要性越強。在此基礎上采用R軟件篩選出30個關鍵節點，制作條形圖，從圖中可以看與IL6連線有31條， VEGFA連線有30條，自由度較高的節點依次為:IL6，VEGFA，CASP3，MAPK8，MYC，NOS3，PPARG，ESR1，FOS，ICAM1等，說明這些靶點之間存在較密切的蛋白互作關系，見圖3、圖4。

圖3 共同靶點PPI網絡

圖4 PPI 網絡關鍵蛋白節點條形圖

2.5 GO 功能富集分析

應用R軟件 colorspace、stringing、DOSE、clusterprofiler、pathviwew 安裝包對銀杏葉-心肌缺血的40個共同作用靶蛋白進行GO生物功能分析，根據P<0.05 確定對應的條目，共42功能富集，繪制排名前20位的GO 條目，見圖5，圖中顏色越紅。半胱氨酸肽鏈內切酶活性(cysteine-type endopeptidase activity)，內肽酶活力(endopeptidase activity)，激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)，DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase II-specific)顏色較紅，表明這些功能富集較密集，表明銀杏葉可通過調控這些功能發揮對類心肌缺血的治療作用。見圖5。

2.6 KEGG通路富集分析

應用R軟件 colorspace、stringing、DOSE、clusterprofiler、pathviwew 安裝包對銀杏葉-心肌缺血的40個共同作用靶蛋白進行KEGG通路富集分析，根據保留P≤0.05的結果，共富集到42條通路，對繪制排名前20位的KEGG氣泡圖，同時對篩選到的核心通路加以注釋。圖中顏色與大小取決于關聯基因Count值和P值，紅色節點越大信號通路的顯著性就越高，說明該條信號通路的重要性越高，X軸表示關聯基因數與信號通路上總基因數的比值，Y軸表示通路名稱。見圖5，通路TNF信號通路(TNF signaling pathway)，糖尿病并發癥的年齡憤怒信號(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)， 細胞凋亡(apoptosis)，PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)表明銀杏葉主要通過調節這些通路來治療心肌缺血，通路富集分析氣泡圖結果見圖6。

圖5 GO 功能富集分析條形圖

圖6 KEGG通路富集氣泡

2.7 通路分析

腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)在KEGG通路富集分中富集程度較高，故對此通道進一步分析，通路圖中紅色標志表明通過影響該基因的表達影響該通路。見圖6，銀杏葉中有效成分通過影響組織蛋白酶(cathepsin)、半胱氨酸蛋白酶- 8(CASP8)、半胱氨酸蛋白酶- 3(CASP3)、半胱氨酸蛋白酶- 7(CASP7)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、核轉錄因子激活蛋白-1(AP-1)、氨基末端激酶1/2(JNK1/2)、氨基末端激酶(JNK)、IkBa 、轉錄因子FOS基因、白細胞介素(IL6)表達、細胞粘著(cell adhesion)、細胞間粘附分子(ICAM1)、血管細胞粘附分子(VCAm1)來影響卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路。見圖7。

圖7 卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路分析圖

3 討 論

心肌缺血是心臟供氧減少，心肌能量代謝不正常，導致的一種病理狀態，現代醫學認為，心肌缺血是由于血壓降低、主動脈供血減少或者冠狀動脈阻塞導致的心臟供血減少 。另外心瓣膜病、血黏度變化、心肌本身病變也會使心肌缺血。雖然目前有文獻報道銀杏葉治療心肌缺血再灌注損傷，大多以大鼠和家兔實驗，以銀杏葉中整體成分為研究，未具體到具體的化學成分，且缺乏專門發病機制的治療策略，其作用機制尚不明確，故基于網絡藥理學預測銀杏葉單味中藥在治療心肌缺血的作用機制和關鍵通路有重要意義。

本研究基于網絡藥理學方法，收集銀杏葉包含的27種高活性化合物，2 164個靶點，與心肌缺血531個疾病相關靶點進行基因映射，獲得40個映射基因，構建了蛋白互作網絡。銀杏葉中槲皮素、山柰酚和毛地黃黃酮幾個成分自由度較高，表明這幾個成分在治療心肌缺血方面占主要作用；PPI蛋白互作網絡中IL6，VEGFA，CASP3，MAPK8，MYC，NOS3，PPARG幾個靶點連線較多，表明主要通過影響這些靶點來治療疾病；GO 功能富集分析顯示銀杏葉治療心肌缺血的基因富集在半胱氨酸肽鏈內切酶活性、內肽酶活力、激活轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性等功能。KEGG 通路富集分析顯示銀杏葉通過影響TNF信號通路、糖尿病并發癥的年齡憤怒信號、 細胞凋亡、PI3K-Akt信號通路等目的，進一步達到對心肌缺血疾病的治療。

本研究所得的結果仍有局限的地方。通過數據挖掘對藥物的功能和作用進行預測，未來還需要在基礎和臨床實驗中進一步證實。另外口服利用度和類藥性的篩選本身也存在著限制，藥物在人體的吸收利用不僅僅局限于口服，目前銀杏葉提取物的注射劑已經廣泛在臨床使用，在以后的新藥預測和開發中還需要重視口服利用度較低的成分，可能有更廣泛的潛在治療作用。本文通過網絡藥理學的方法，探索銀杏葉可能作用于心肌缺血的關鍵靶基因及信號通路，為中藥研究提供新的思路與方法。