人TBC1D10C基因過表達慢病毒載體的構建及功能鑒定

程闊菊 吳慶 周殿儒 馮勝紅 羅健華 黃河 王毅

【摘要】目的 構建人TBC1D10C（hTBC1D10C） 基因過表達慢病毒載體，并對其進行功能鑒定。方法 利用PCR技術擴增hTBC1D10C基因片段，構建pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro過表達載體質粒，將構建的過表達載體質粒和系統包裝質粒應用高效轉染試劑盒轉染至293T細胞，以包裝rLV-hTBC1D10C-zpp，在HEK293細胞中檢測病毒滴度。rLV-hTBC1D10C-zpp感染H9C2心肌細胞，蛋白免疫印跡法檢測hTBC1D10C 蛋白表達。結果 pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro過表達質粒構建成功，rLV-hTBC1D10C-zpp包裝順利，滴度為1×108 TU/ml，感染H9C2心肌細胞后，hTBC1D10C蛋白表達上調（P < 0.05）。結論 rLV-hTBC1D10C-zpp構建成功，在心肌細胞中具有高效表達hTBC1D10C的效應。

【關鍵詞】人TBC1D10C;Carabin;慢病毒載體

【Abstract】Objective To construct a lentivirus vector overexpressing human TBC1D10C （hTBC1D10C） gene and identify its function. ?Methods The hTBC1D10C gene fragment was amplified by PCT. Human TBC1D10C gene fragment was inserted into the vector overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro. Then， the vector plasmid overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro and system packaging plasmid were transfected into 293T cells using HET high-efficiency transfection reagent to package rLV-hTBC1D10C-zpp. The viral titer was detected in HEK293 cells. H9C2 myocardial cells were infected with rLV-hTBC1D10C-zpp. The expression level of hTBC1D10C protein was detected by Western blot. ?Results The plasmid overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro was successfully constructed. rLV-hTBC1D10C-zpp was successfully packaged with a titer of 1x108TU/ml. The expression level of hTBC1D10C protein was significantly up-regulated after H9C2 myocardial cells were infected （P < 0.05）. Conclusion rLV-hTBC1D10C-zpp is successfully constructed， which can overexpress hTBC1D10C in cardiomyocytes.

【Key words】Human TBC1D10C;Carabin;Lentivirus vector

TBC1D10C是2007年在人T淋巴細胞中發現的一個新的鈣調磷酸酶（CaN）結合蛋白，主要表達于脾臟及血液中，同時可與Ras結合，基于其與CaN和Ras均能相互作用的特性，將其命名為carabin[1]。有研究表明，它作為CaN的內源性負反饋抑制蛋白通過CaN和Ras信號通路負反饋抑制T淋巴細胞及B淋巴細胞的持續活化，在機體免疫中發揮著重要作用[2-4]。最近研究表明，TBC1D10C在心肌細胞中亦有表達，可通過負性調節CaN和Ras信號通路抑制心肌細胞的肥大，并有可能成為診治心力衰竭的心肌肥厚靶點[5-6]。我們的前期研究發現，TBC1D10C在小鼠梗死心臟及經缺血/缺氧處理的人心室肌細胞株AC16中表達均顯著下調，提示TBC1D10C在心肌梗死及缺血中可能會起到一定的作用，但目前尚未見相關研究報道[7]。鑒于此，本研究擬采用慢病毒載體系統，構建人TBC1D10C慢病毒過表達載體（rLV-hTBC1D10C-zpp），感染H9C2心肌細胞驗證TBC1D10C過表達效果，為進一步觀察TBC1D10C信號通路在心肌細胞中的作用奠定基礎。

材料與方法

一、材 料

1. 材 料

293T細胞株及慢病毒過表達載體質粒（pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro， Amp+）購自深圳百恩維生物科技有限公司。pUC57-hTBC1D10C質粒（hTBC1D10C模板質粒）由本實驗室提供。

2. 主要試劑及儀器

JM109感受態細胞（深圳百恩維生物科技有限公司），DNA引物合成（美國Invitrogen公司），DNA測序（美國Invitrogen公司），限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ（美國NEB公司），胎牛血清（C2027050，美國Invitrogen公司），慢病毒包裝試劑盒（BW12008-20，深圳百恩維生物科技有限公司），超凈工作臺BCM-1600A（蘇州蘇凈安泰公司），Bio-Rad凝膠成像系統Gel Imager，Gel-Doc（美國Bio-Rad公司）。

3. 引物設計及合成

針對pUC57-hTBC1D10C質粒設計基因引物：pUC57-hTBC1D10C-EcoRⅠ-F：5-CCGGAATT-CGCCACCATGGCCCAGGCCCTGGGGGAG-3;pUC57-hTBC1D10C-BamHⅠ-R：5-CGCGGATCC-TCAGAAGCGGGTGTCCAGGAAGGAGGTG-3（加粗標記位點為酶切位點）。引物的設計和合成由美國Invitrogen公司完成。

二、方 法

1. pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體的構建

PCR擴增在引物中引入了EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位點的hTBC1D10C，瓊脂糖凝膠回收目的條帶，提取目的基因NDA。對載體質粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro和回收的目的hTBC1D10C基因行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切片段在T4 DNA Ligase的作用下連接，將連接產物轉化至JM109感受態細菌，接種于含Amp+的培養基平板，次日挑選陽性單克隆菌群，Amp+藥液培養過夜，提取質粒，經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性后送美國Invitrogen公司進行測序驗證。

2. rLV-hTBC1D10C-zpp慢病毒的包裝、收集、擴增及滴度測定

將攜帶目的hTBC1D10C基因的重組質粒pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro以及系統包裝質粒用高效轉染試劑盒（HET）轉染至293T細胞，轉染12 ～ 16 h后更換新鮮的完全培養基，換液后24 h收集病毒上清液置4℃冰箱保存，加入10 ml培養基繼續培養，24 h后收集細胞和上清液置于離心管中，凍融3次與之前的病毒上清液合并，2000 rpm 離心 5 min，取上清即為病毒液初代原液。連續三代反復擴增收集病毒后，行病毒的大量擴增，對其純化和濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在人胚腎組織細胞293（HEK293）細胞中按照慢病毒包裝試劑盒說明書測定并標定病毒滴度。

3. rLV-hTBC1D10C-zpp 功能鑒定

H9C2傳代至108/L時接種于6孔板中，當細胞生長至90%融合時，每孔加入含1×105/L病毒的100 μl病毒液，孵育4 h后更換培養基，40 h后收集蛋白，蛋白免疫印跡法檢測hTBC1D10C 蛋白表達。

三、統計學處理

應用SPSS 22.0對實驗數據進行統計分析。正態分布計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗;非正態分布計量資料以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用秩和檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體的構建DNAMAN 比對分析pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro質粒的基因測序結果，結果顯示與hTBC1D10C序列一致（見圖1），表明載體構建成功。

二、rLV-hTBC1D10C-zpp慢病毒的包裝、收集、擴增及滴度測定

將制備的重組質粒pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro以及系統包裝質粒共轉染293T 細胞后，分別于24 h及48 h時進行收集。在HEK293細胞中按照慢病毒包裝試劑盒說明書測定并標定病毒滴度。慢病毒rLV-hTBC1D10C-zpp滴度為：1×108 TU/ml，見圖2。

三、rLV-hTBC1D10C-zpp 功能鑒定

將構建成功的rLV-hTBC1D10C-zpp感染H9C2心肌細胞，48 h后提取總蛋白行蛋白免疫印跡法驗證。結果顯示，hTBC1D10C過表達組hTBC1D10C蛋白比對照組上升（t = 9.574，P < 0.001）。蛋白免疫印跡法驗證hTBC1D10C過表達成功，結果見圖3。

討論

TBC1D10C是2007年Pan等[1]用酵母雙雜交技術在人T淋巴細胞中對CaN結合蛋白進行篩選時所發現的一個新的CaN結合蛋白，同時可與Ras結合。經結構鑒定，TBC1D10C蛋白含有一個CaN 結合區域和一個Ras結合區域：CaN結合區域位于羧基端，其最小結合區域為羧基末端的41個氨基酸殘基（aa406-446）;Ras結合區域為氨基端的89位到294位氨基酸（aa89-294）[1]。經在體和離體實驗的功能鑒定：①CaN 結合區域，TBC1D10C的轉錄和表達依賴于CaN信號通路的活化，而產生的TBC1D10C可與CaN結合，進而抑制CaN信號通路，因此TBC1D10C是作為CaN的負反饋抑制蛋白來發揮其調節作用的;②Ras結合區域，具有Ras GAP活性，可特異性地抑制Ras/ERK1/2信號通路。前期研究表明，在T淋巴細胞及B淋巴細胞中TBC1D10C作為CaN的內源性負反饋抑制蛋白通過CaN-NFAT和Ras/ERK1/2信號通路負反饋抑制T淋巴細胞及B淋巴細胞的持續活化，在機體免疫中發揮著重要作用[1-4]。最近研究表明，TBC1D10C在心肌細胞中亦有表達，可通過負性調節CaN-NFAT、Ras/ERK1/2CaN及Ras-CaMKⅡ信號通路抑制心肌細胞的肥大，并有可能成為診治心衰的心肌肥厚靶點[5-6]。

我們的前期研究顯示，在小鼠冠狀動脈左前降支結扎誘導的心肌梗死動物模型中，術后第7日及第14日梗死區域TBC1D10C的mRNA及蛋白表達水平均顯著下調，同時在經缺血/缺氧處理的人心室肌細胞株AC16中表達亦均顯著下調[7]。那么下調的TBC1D10C在心肌梗死中是否會起到一定的作用呢，目前尚無相關研究報道。如前所述，TBC1D10C為一新發現的蛋白，目前尚未發現其特異性激活劑，鑒于此，本研究利用慢病毒載體，定向克隆人TBC1D10C基因，以此達到TBC1D10C過表達的作用，為TBC1D10C的研究奠定基礎。

伴隨著分子生物學技術的不斷發展與成熟，各種可以改變基因表達水平的手段和方法日趨進步。目前，用于外源性基因導入的載體主要包括質粒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒和逆轉錄病毒載體。與其他載體相比，慢病毒載體對非分裂和分裂細胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主細胞染色體上，使外源性基因能長期穩定的高效表達[8-10]。使得慢病毒成為實現長期穩定高效表達的理想載體。因考慮后期研究涉及動物及細胞實驗，對過表達轉染效率要求高，因此研究組決定采用腺病毒載體構建人TBC1D10C過表達載體。

在rLV-hTBC1D10C-zpp構建過程中，我們首先將人TBC1D10C基因定向克隆至pLVX-hTBC1-D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體，經測序驗證后與系統包裝質粒共轉染293T細胞，培養24 ～ 48 h后收集病毒原液，再連續三代反復行病毒擴增。病毒滴度測定后，感染H9C2心肌細胞行rLV-hTBC1D10C-zpp功能鑒定，蛋白免疫印跡法驗證hTBC1D10C過表達成功說明rLV-hTBC1D10C-zpp構建成功。rLV-hTBC1D10C-zpp的成功構建為TBC1D10C在心肌梗死及缺血中的作用機制奠定了實驗基礎。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-08-12）

（本文編輯：楊江瑜）