摻入外源淀粉的魔芋豆腐體外消化和發(fā)酵性能研究

雷 雯 鐘 耕 張東霞 黃思雨

(西南大學食品科學學院，重慶 400715)

魔芋豆腐是魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)在堿性條件下加熱時脫除乙酰基形成的熱不可逆凝膠。研究表明，脫乙酰基使KGM分子間的氫鍵連接增強，螺旋結(jié)構(gòu)消失[1-2]，降低了聚合物固有的水溶性[3]，使KGM持水性變差，極易發(fā)生脫液收縮現(xiàn)象[4]，使魔芋豆腐在常溫下軟塌無彈性，影響商品性。此外，高純度KGM制作的魔芋豆腐加熱時口感偏硬。因此，為改善魔芋豆腐外觀和食用品質(zhì)，制作魔芋豆腐時常添加淀粉。孫健等[5]通過將羥丙基淀粉添加到魔芋精粉中制作魔芋豆腐，改善了魔芋豆腐的硬度和析水率。

KMG在上消化道中不被消化，但在大腸中會被腸道菌群酵解[6-7]。目前大量研究集中于KGM的抗肥胖和控制血糖[8]、降膽固醇[9]、降血脂[10]、抗炎活性[11]、改善結(jié)腸生態(tài)、緩解便秘[12-13]、抗醉解酒[14]等功能作用。而關(guān)于魔芋豆腐的研究大都集中于魔芋豆腐的凝固條件、魔芋粉與其他原料(黃原膠[15]、卡拉膠[5]、淀粉[6]等)復(fù)配改善魔芋的硬度與持水性、堿促進KGM凝膠的機理[4,16]等。現(xiàn)有許多生產(chǎn)商為改善魔芋豆腐品質(zhì)向魔芋豆腐中添加淀粉，但添加淀粉后對魔芋豆腐的健康價值是否有影響尚無相關(guān)研究。

試驗擬對純魔芋豆腐、摻入芭蕉芋淀粉和玉米淀粉的魔芋豆腐進行體外模擬消化和小鼠盲腸體外模擬發(fā)酵，以芭蕉芋淀粉和玉米淀粉為對照，探討摻入淀粉對魔芋豆腐消化性能和盲腸發(fā)酵性能的影響，為魔芋制品的健康消費提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

純化花魔芋精粉：KGM含量74.81%(干基計)，黏度41 400 mP·s，未檢出含淀粉，四川森態(tài)源食品有限公司；

玉米淀粉：河北省玉峰實業(yè)集團有限公司；

芭蕉芋淀粉：貴州省興義市余江芭蕉芋淀粉廠；

小鼠：雄性SPF級成年KM小鼠，許可證號SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；

Ca(OH)2、HCl、NaOH、NaCl、葡萄糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)、糖化酶(10萬U/g)：北京索萊寶科技有限公司；

MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；

豬胰酶：10萬U/g，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

酸度計：PB-10型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

真空冷凍干燥機：SY-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

紫外—可見分光光度計：759型，上海菁華科技儀器有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 參照孫健等[5]的方法，修改如下：稱取一定量魔芋粉與淀粉置于250 mL燒杯中，加入蒸餾水將總質(zhì)量補為100 g。沸水浴中糊化20 min，糊化過程中不斷攪拌。糊化后補償糊化過程中散失的水分，于70 ℃水浴溶脹20 min，加入一定量質(zhì)量分數(shù)10%的Ca(OH)2懸濁液攪拌均勻，靜置30 min，在蒸鍋中蒸30 min即制成魔芋豆腐。真空冷凍干燥、粉碎、過100目篩置于干燥器中備用。

1.2.2 體外模擬消化

(1) 體外模擬口腔消化：根據(jù)Ruth等[17]的方法測定人體唾液及唾液中淀粉酶的活性。體外模擬口腔消化試驗根據(jù)陳春[18]的方法，修改如下：將各樣品配置成2 mg/mL 的水溶液，向A1～A5試管中依次加入2 mL唾液和樣品溶液，向B1～B5試管中依次加入2 mL樣品溶液和蒸餾水，向C試管中加入2 mL唾液和蒸餾水。將上述試管置于37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育5 min，沸水浴中滅酶5 min。用DNS法測定各管中還原糖含量，并按式(1)計算淀粉水解率。

(1)

式中：

H口腔——模擬口腔消化時淀粉水解率，%；

GA——反應(yīng)后A管還原糖含量，g；

GB——反應(yīng)后B管還原糖含量，g；

GC——反應(yīng)后C管還原糖含量，g；

m淀——樣品中淀粉質(zhì)量，g。

(2) 體外模擬胃、腸道消化：根據(jù)Román等[19]的方法略做修改。取1.00 g樣品于25 mL 磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中分散，37 ℃預(yù)保溫10 min，用2 mL HCl溶液(1 mol/L)將消化液pH調(diào)至2.0，然后加入0.75 mL胃蛋白酶溶液(2 mg/mL，含9 g/L NaCl)，孵育30 min。用2 mL NaOH溶液(1 mol/L)將pH調(diào)至6.8，加入5 mL豬胰酶溶液(50 mg/mL)，37 ℃溫育4 h，分別于模擬胃消化0，30 min，模擬小腸消化0，20，40，60，90，120，150，180，240 min 時取200 μL消化液加至含1 mL無水乙醇的離心管中以停止酶促反應(yīng)，將樣品在4 ℃下以10 000 r/min 離心5 min。沉淀物用400 μL 75%乙醇洗滌1次，合并上清液。取300 μL上清液用1 600 μL乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L pH 4.5)稀釋，加入100 μL糖化酶溶液(25 mg/mL)，50 ℃孵育30 min。取出后用DNS法測定還原糖含量，按式(2)～(4)分別計算模擬胃、小腸淀粉水解率及樣品中抗性淀粉含量。

(2)

(3)

(4)

式中：

H胃——模擬胃消化時淀粉水解率，%；

G胃——模擬胃消化30 min時還原糖含量，g；

G0——模擬胃消化0 min時還原糖含量，g；

m淀——樣品中淀粉質(zhì)量，g；

H小腸——模擬小腸消化時淀粉水解率，%；

ΔG——取樣點與模擬小腸消化0 min時還原糖含量變化，g；

RS——抗性淀粉含量，%；

G120——模擬小腸消化120 min時還原糖含量，g。

1.2.3 小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵 將1.2.2中模擬小腸消化4 h后的消化液置于孔徑為3 500 Da截留分子尺寸的透析袋中，4 ℃下用去離子水透析。透析后，通過DNS法測定透析袋中還原糖含量確保去除所有還原糖，并將保留物冷凍干燥[20]。

根據(jù)秦清娟等[7]的方法制備盲腸內(nèi)容物稀釋液，根據(jù)文獻[21]的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基。向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分數(shù)1%的消化后凍干樣品作為碳源，陽性對照組加入質(zhì)量分數(shù)1%的葡萄糖，陰性對照組不加任何碳源。再加入體積分數(shù)10%的盲腸內(nèi)容物稀釋液，混合均勻，通入氮氣排除發(fā)酵罐中空氣，密封。以上操作均在無菌臺進行，每組樣品設(shè)置5瓶，于37 ℃厭氧發(fā)酵箱中分別培養(yǎng)0，4，8，12，24 h，向瓶中加入100 μL質(zhì)量分數(shù)1%的硫酸銅溶液終止發(fā)酵[8]。

1.2.4 發(fā)酵液pH的測定 在加入硫酸銅溶液前用酸度計直接測定發(fā)酵液的pH值[22]。

1.2.5 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFA)含量測定 將發(fā)酵液5 000 r/min離心20 min，取0.5 mL上清液，分別加入 50%乙醇0.5 mL，濃鹽酸3 μL，渦旋振蕩3 min，40 W超聲處理20 min，再5 000 r/min離心20 min，取上清液過0.25 μL濾膜，經(jīng)氣相色譜測定SCFA含量[23]。以乙酸、丙酸、丁酸標準品繪制標準曲線。氣相色譜柱：DB-FFAP柱(30 m×0.53 mm×0.50 μm)；升溫程序：柱溫80 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 升溫至200 ℃，保持1 min；壓力60.1 kPa；進樣量1 μL；尾吹流量30.0 mL/min，氫氣流量40.0 mL/min，空氣流量400.0 mL/min[24]。

1.2.6 發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量測定 按GB 4789.35—2016執(zhí)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示有顯著差異。采用Origin lab 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋豆腐配方優(yōu)化

前期試驗發(fā)現(xiàn)，魔芋豆腐中摻入淀粉可改善魔芋豆腐的軟硬度，但不同淀粉理化性質(zhì)差異較大，要達到同等品質(zhì)的魔芋豆腐，不同種類淀粉的添加量不同。以魔芋豆腐的硬度和持水性為指標，通過正交試驗優(yōu)化得到純魔芋豆腐、芭蕉芋淀粉魔芋豆腐、玉米淀粉魔芋豆腐的配方，如表1所示。

表1 魔芋豆腐配方Table 1 Konjac tofu formula %

由表2可知，芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐的持水性顯著高于純魔芋豆腐，且25 ℃時，芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐硬度顯著大于純魔芋豆腐，改善了常溫時魔芋豆腐的外觀。人進食魔芋豆腐的溫度在45 ℃左右，此時芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐的硬度顯著低于純魔芋豆腐，改善了純魔芋豆腐加熱后食用口感偏硬的問題。

表2 魔芋豆腐的持水性與硬度?Table 2 Water holding capacity and hardness of konjac tofu

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 純魔芋豆腐在體外模擬消化時的還原糖生成量

體外模擬口腔、胃、小腸消化過程中，純魔芋豆腐組均無還原糖產(chǎn)生，表明脫乙酰基魔芋葡甘聚糖(D-KGM)不會在口腔、胃、小腸中被水解生成還原糖，淀粉魔芋豆腐中生成的還原糖均來自摻入的淀粉。

2.3 體外模擬口腔和胃消化時的淀粉水解率

碳水化合物消化過程中，人體口腔主要有兩個作用：① 通過咀嚼將食物轉(zhuǎn)化為小顆粒；② 通過分泌α-淀粉酶將多糖大分子分解成小分子[15]。試驗中樣品均通過粉碎、過100目篩，分子顆粒大小相同，因此主要模擬唾液α-淀粉酶對多糖的水解作用。試驗測得收集的唾液中α-淀粉酶活力為(82±5) D/mL，與Ruth等[17]的結(jié)果相吻合。

由表3可知，純芭蕉芋淀粉和純玉米淀粉在口腔中的水解率無顯著差異，而對應(yīng)的淀粉魔芋豆腐中淀粉的水解率顯著降低，說明D-KGM可以阻礙淀粉在口腔中消化。消化過程中，胃部不分泌分解糖類相關(guān)的水解酶，但胃中的強酸環(huán)境能使多糖糖苷鍵斷裂、相對分子質(zhì)量降低[25]。體外模擬胃消化過程中，各魔芋豆腐組均無還原糖產(chǎn)生。

表3 體外模擬口腔和胃消化時的淀粉水解率?Table 3 Hydrolysis rate of starch during simulating oral and gastric digestion in vitro %

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 體外模擬小腸消化時的淀粉水解率

由圖1可知，淀粉水解率均先快速上升后緩慢上升再趨于穩(wěn)定。大部分水解在0～20 min內(nèi)完成，為快消化淀粉，能使血糖快速升高[26]。純玉米淀粉的水解率高于純芭蕉芋淀粉，是由于淀粉品種差異。與純淀粉相比，對應(yīng)的淀粉魔芋豆腐的淀粉水解率均降低，但0～20 min的降低效果顯著(圖2)，而最終水解程度差異不顯著，說明D-KGM在腸道消化中可以延緩摻入淀粉的消化性能，但不能阻止淀粉消化。研究[27]表明KGM會使食物黏度增加而降低消化程度，試驗中D-KGM黏度遠低于KGM，淀粉水解程度并未降低，但由于D-KGM與淀粉共混，一定程度地阻礙了淀粉與酶的接觸，延緩了淀粉的水解。經(jīng)120 min消化后，未被水解的淀粉為抗性淀粉，純芭蕉芋淀粉、芭蕉芋魔芋豆腐、純玉米淀粉、玉米魔芋豆腐中抗性淀粉占總淀粉的比例分別為(22.36±1.11)%，(23.57±2.85)%，(17.41±1.78)%，(19.47±1.68)%，與未被水解的D-KGM一起進入大腸中被微生物酵解。

圖1 體外模擬小腸消化時淀粉水解率隨消化時間的變化Figure 1 The hydrolysis rate of starch changes with digestion time during simulating small intestine digestion in vitro

圖2 體外模擬小腸消化20 min時的淀粉水解率Figure 2 The hydrolysis rate of starch when simulating small intestine digestion for 20 min in vitro

2.5 酵解過程中pH的變化

由圖3可知，小鼠盲腸體外發(fā)酵過程中，空白組pH值無顯著變化，其他各組pH值呈下降趨勢，且0～4 h下降最快。純芭蕉芋淀粉和純玉米淀粉組在8 h后pH值不再下降，玉米魔芋豆腐組在12 h后pH值不再下降，純魔芋豆腐、芭蕉芋魔芋豆腐和葡萄糖組在發(fā)酵24 h內(nèi)pH值持續(xù)下降，但隨著發(fā)酵時間的延長，pH值下降速度持續(xù)減緩。整個過程中，葡萄糖組pH值下降得最快最多，葡萄糖最易被腸道微生物利用，其次為純芭蕉芋淀粉組和純玉米淀粉組，純魔芋豆腐組下降得最慢最少。綜上可知，發(fā)酵過程中，玉米和芭蕉芋抗性淀粉組降低發(fā)酵液pH值能力高于D-KGM，前者降低pH值的持續(xù)時間短，而后者能持續(xù)緩慢降低pH值，摻入淀粉的魔芋豆腐組趨勢介于二者之間。

圖3 發(fā)酵液中pH值隨發(fā)酵時間的變化Figure 3 The pH of the fermentation broth changes with the fermentation time

2.6 酵解過程中SCFA含量的變化

在SCFA中，乙酸是人體腸道內(nèi)細菌發(fā)酵多糖最主要的產(chǎn)物[28]。由表4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中乙酸產(chǎn)量均顯著增加，且大于空白組和葡萄糖組。發(fā)酵0～4 h，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸較少，但隨著發(fā)酵時間的增加，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸速率不斷增加，發(fā)酵24 h時，乙酸產(chǎn)量遠遠高于其他組。發(fā)酵24 h時，各含淀粉魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸量顯著(P<0.05)高于不含魔芋粉的純淀粉組，說明D-KGM被微生物利用，產(chǎn)生乙酸的能力顯著大于抗性淀粉。隨著發(fā)酵時間的增加，丙酸產(chǎn)量逐漸增加，發(fā)酵0～8 h時，純魔芋豆腐組和芭蕉芋魔芋豆腐組產(chǎn)丙酸速率極為緩慢，發(fā)酵8 h后產(chǎn)丙酸速率增加。發(fā)酵24 h時，純魔芋豆腐組丙酸產(chǎn)量顯著高于其他組，芭蕉芋魔芋豆腐組丙酸產(chǎn)量顯著高于純芭蕉芋淀粉組，說明D-KGM被微生物利用，產(chǎn)生丙酸的能力顯著大于抗性淀粉。隨著發(fā)酵時間的增加，樣品組丁酸產(chǎn)量增加且高于葡萄糖組。發(fā)酵24 h時，純淀粉組產(chǎn)丁酸量顯著高于純魔芋豆腐組，但摻入淀粉的魔芋豆腐組產(chǎn)丁酸量均低于純淀粉組和純魔芋豆腐組，說明淀粉和魔芋粉復(fù)配形成的凝膠被微生物利用，生產(chǎn)丁酸的能力低于淀粉和魔芋粉各自產(chǎn)丁酸的能力。各樣品組總短鏈脂肪酸生成量均大于陰性對照組和陽性對照組。發(fā)酵24 h時，純魔芋豆腐組總短鏈脂肪酸生成量最多，純芭蕉芋淀粉組和純玉米淀粉組生成量最少，且二者無顯著差異(P>0.05)。玉米魔芋豆腐摻入淀粉量遠高于芭蕉芋魔芋豆腐，而前者生成總酸量顯著低于后者，說明D-KGM發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸的能力顯著大于抗性淀粉，與2.5中pH值的變化曲線不相符，可能是因為葡萄糖和抗性淀粉發(fā)酵的主要產(chǎn)物是長鏈脂肪酸或其他有機酸[29]。

表4 不同發(fā)酵時間各種短鏈脂肪酸生成量?Table 4 The yield of various short chain fatty acid at different fermentation times mmol/L

? NP表示未生成；同行小寫字母不同表示有顯著差異(P<0.05)，同列大寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，純淀粉組短鏈脂肪酸的生成主要在發(fā)酵0～12 h，純魔芋豆腐組主要在12～24 h，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸和丙酸能力高于純淀粉組，產(chǎn)丁酸能力反之，與Zhao等[30-31]對KGM和抗性淀粉的研究結(jié)果一致。摻入淀粉的魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸和丙酸能力介于純魔芋粉和純淀粉之間，產(chǎn)丁酸能力低于二者，而芭蕉芋魔芋豆腐產(chǎn)短鏈脂肪酸能力顯著高于玉米魔芋豆腐。

2.7 酵解后乳酸菌含量的變化

由表5可知，各試驗組乳酸菌含量顯著增加，其中純魔芋豆腐組的含量最高，純淀粉組的含量最少，淀粉魔芋豆腐組介于二者之間，且均高于葡萄糖組。多數(shù)乳酸菌不能利用淀粉，由于其不能產(chǎn)生水解淀粉的酶，但仍有研究[29,32]發(fā)現(xiàn)抗性淀粉會促進腸道乳酸菌的增長，可能是因為腸道菌群是復(fù)雜的體系，存在許多協(xié)同作用，其他細菌降解抗性淀粉產(chǎn)生的物質(zhì)足以支持乳酸菌的生長[33]。試驗結(jié)果證明D-KGM、芭蕉芋抗性淀粉、玉米抗性淀粉都能促進乳酸菌的生長，但抗性淀粉的益生作用低于D-KGM，與2.6中生成短鏈脂肪酸的規(guī)律相同。

表5 發(fā)酵24 h后發(fā)酵液中乳酸菌含量?Table 5 Lactic acid bacteria content in fermentation broth after fermentation for 24 h lg(CFU/mL)

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，純魔芋豆腐在上消化道中不被消化，摻入魔芋豆腐中的淀粉會被快速消化，但與純淀粉相比，摻入魔芋豆腐中的淀粉在體外模擬口腔和小腸消化的0～20 min內(nèi)水解率顯著降低，但小腸消化結(jié)束后水解率無顯著變化，說明D-KGM在短時間內(nèi)可以阻礙淀粉消化，但并不能阻止淀粉最終消化；體外模擬小鼠盲腸發(fā)酵結(jié)果顯示魔芋豆腐中摻入淀粉后腸道益生作用會減弱；為改善魔芋豆腐食用品質(zhì)和商品性而加入淀粉后其健康價值降低，但在魔芋豆腐達到相同食用品質(zhì)和持水性時，芭蕉芋淀粉添加量遠低于玉米淀粉。因此，向魔芋豆腐中添加芭蕉芋淀粉能在提高魔芋豆腐品質(zhì)的同時盡可能少地降低其健康價值。后續(xù)可對摻入淀粉后魔芋豆腐微觀結(jié)構(gòu)變化進行深入研究，為淀粉在魔芋豆腐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)；研發(fā)一種簡便地鑒別魔芋豆腐中淀粉摻入量和摻入淀粉種類的方法，為消費者自主選擇是否購買摻入淀粉的魔芋豆腐提供保障。