丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機制及高密度厭氧發(fā)酵方式研究進展

吳天福 謝小林 陳美標 周 蓮 陳 猛 鄧名榮 姚 青 朱紅惠

(1. 廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；2. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070；3. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；4. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東 廣州 510070；5. 華南農業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642)

丁酸梭菌又名酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、宮入菌[1]，屬于硬壁菌門梭菌科梭菌屬。它是從健康人、動物腸道、酒窖泥或環(huán)境土壤中分離出的革蘭氏陽性嚴格厭氧梭菌[2]，具有耐胃酸、耐膽汁等特性，能夠經過胃和小腸，到達完全厭氧的盲腸和結腸中進行定植、繁殖和代謝。丁酸梭菌在代謝過程中能產生多種酶將腸道中多糖物質分解為低聚糖[3]，并產生丁酸梭菌素(抗菌肽)、丁酸、乙酸及維生素等多種次級代謝產物，具有促進腸道內有益菌生長，抑制有害菌繁殖，糾正腸道菌群紊亂。此外，還能修復腸道黏膜，增強腸道屏障功能的作用[4]，從而提高飼料利用率，維護動物腸道健康，提高生產性能。因此，在亞洲特別是日本、韓國和中國丁酸梭菌被廣泛用作益生菌劑，作為醫(yī)藥中的整腸劑及畜禽、水產養(yǎng)殖中的飼料添加劑[5]。丁酸梭菌作為新一代的芽孢益生菌劑，對于減少抗生素的濫用、減少肉制品中藥物殘留、降低動物細菌的耐藥性和保障動物健康方面有著重要的意義。

目前，中國對丁酸梭菌的研究仍然處于起步階段，市面上銷售的丁酸梭菌益生菌劑因有效活菌數低，普遍發(fā)酵水平在108～109數量級上，個別企業(yè)經發(fā)酵噴霧干燥后有效活菌數能達到1×1010CFU/g，但一般產量小且價格昂貴，難以滿足食品、動物養(yǎng)殖及飼料行業(yè)對丁酸梭菌高需求量、高有效活菌數且價格低廉的要求[3]。造成這種現狀最主要的問題在于丁酸梭菌高密度發(fā)酵技術不成熟，厭氧發(fā)酵生物反應器智能化程度低，工業(yè)化、規(guī)模化發(fā)酵技術不完善，這些問題嚴重制約了丁酸梭菌的廣泛推廣及應用。此外，發(fā)酵初始pH值、溫度、底物種類[6]及無機鹽離子[7]等發(fā)酵工藝的優(yōu)化及發(fā)酵過程代謝調控優(yōu)化等因素對丁酸梭菌高密度發(fā)酵也有很大的影響。因此，丁酸梭菌規(guī)模化生產關鍵技術研究和用于厭氧發(fā)酵的生物反應器設計等問題亟待解決和突破。文章從丁酸梭菌的厭氧發(fā)酵機制、發(fā)酵方式及厭氧發(fā)酵生物反應器的應用狀況等幾個方面進行綜述，以期能在丁酸梭菌實際生產及應用等方面提供解決思路和策略，實現丁酸梭菌的高密度厭氧發(fā)酵，大幅度提高有效活菌數及降低工業(yè)生產成本。

1 丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機制

丁酸梭菌屬于嚴格厭氧菌，其碳代謝途徑中關鍵酶丙酮酸—鐵氧還蛋白氧化還原酶，屬于金屬蛋白酶類，含有鐵硫簇和硫胺素焦磷酸，能催化丙酮酸分解為乙酰-COA和CO2，進一步被氧化為丁酸等代謝產物(圖1)。該蛋白酶在純氧中1 h內活性降低約50%，而在氮氣中24 h仍有較高活性[8]，可見氧含量對丁酸梭菌高密度發(fā)酵是關鍵因素和關鍵控制點。因此，對丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機制的深入了解有助于丁酸梭菌發(fā)酵方法、發(fā)酵工藝及發(fā)酵設備等方面的改進，從而實現丁酸梭菌的高密度發(fā)酵，促進丁酸梭菌的廣泛應用。

丁酸梭菌厭氧發(fā)酵是一個生化轉化的過程，反應過程大致可分為水解、酸化、產氫產乙酸3個階段[9]。第1階段是水解階段，丁酸梭菌將復雜的有機底物(如多糖、蛋白質、脂肪等)在胞外酶(淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纖維素酶、磷脂合成酶等)作用下分解成小分子有機物，如可溶性單糖、氨基酸、脂肪酸和甘油等小分子有機化合物，這些小分子有機物進入細胞內被進一步利用；第2階段是酸化階段，小分子有機物進入細胞胞漿內，在相關酶系作用下轉化為乙酸、丁酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸和乙醇、丙二醇等醇類；第3階段是產氫、產乙酸階段，在相關酶作用下脂肪酸、醇類等物質被氧化分解為氫氣、二氧化碳等氣體。丁酸梭菌代謝途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與CO2在PEP羧化酶催化下形成草酰乙酸(OAA)，進入TCA循環(huán)的氧化支路和還原支路[10-11]。由于丁酸梭菌缺少琥珀酸硫激酶和琥珀酸脫氫酶，無法合成琥珀酸及延胡索酸造成TCA循環(huán)中斷，形成不完全TCA循環(huán)[10](圖1)。此外，丁酸梭菌還存在以NADH為輔酶的蘋果酸支路，催化蘋果酸和乙酰-COA轉化為丙酮酸[12]。在整個代謝過程中產生大量有機酸產生，降低發(fā)酵液pH值，不利于丁酸梭菌的增殖生長。

在微生物發(fā)酵過程中，當培養(yǎng)基中碳源比例過高時，有機物則通過糖酵解途徑生成大量丙酮酸，一部分進入三羧酸循環(huán)用于微生物自身生長，另一部分則進入其他代謝途徑生成乙酸、乳酸和乙偶姻等代謝產物，出現碳溢流代謝(carbon overflow metabolism，COM)現象[15]6。丁酸梭菌在發(fā)酵過程中也存在碳溢流代謝現象，COM產生的丁酸、乙酸等有機酸大量積累導致發(fā)酵液pH下降，細胞質酸化，質子動勢解偶聯等一系列生理毒害結果，出現“酸肋迫效應”[16]。細胞為了維持胞內pH穩(wěn)定將通過消耗額外能量將質子泵入胞內，這一耗能過程會直接影響菌體的正常增殖生長[17]。因此，在丁酸梭菌培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過程中要控制適宜C/N減少碳溢流代謝，或添加適當輕質碳酸鈣、氯化鈣、碳酸鈉等弱堿鹽或流加氨水、低濃度氫氧化鈉溶液調節(jié)發(fā)酵液氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)。此外，還可以通過補加新鮮培養(yǎng)基，減少或消除溢流代謝產物，維持菌體持續(xù)生長從而提高菌體生物量或某種代謝產物的產量[18]。Goel等[19]研究表明，在枯草芽孢桿菌生長過程中，檸檬酸鹽和葡萄糖共代謝，可有效抑制丙酮酸激酶，減少丙酮酸的生成從而抑制EMP碳通量，減少或消除碳溢流代謝。

此外添加檸檬酸鹽還能顯著提高PEP含量，增強TCA循環(huán)和HMP途徑，可促進細胞快速增殖生長。夏會麗等[20]研究表明，添加乙醛可使NADH的氧化由丁酸合成途徑部分向乙醇合成支路遷移，增強乙醇合成效率，降低丁酸、乙酸的積累，提高丁酸梭菌的生長效率。實現了高生物量和低產酸的相對統一。黃志華等[21]研究表明，不同微生物都有其最適的ORP。ORP值越高說明溶液的氧化水平越高越容易失去電子，反之亦然[22]。一般而言，好氧菌適宜的ORP范圍在0.3～0.4 V，兼性厭氧菌在0.1 V左右，厭氧菌在0.1 V以下[23]。微生物調節(jié)胞內ORP的物質主要是輔酶Ⅰ(NADH/NAD+)和輔酶Ⅱ(NADPH/NADP+)，但胞外發(fā)酵環(huán)境中的溫度、pH值及氧化還原物質濃度等都會對ORP產生一定影響。因此，在厭氧菌發(fā)酵過程中，可通過添加適量還原性物質以調控胞外氧化還原電勢，改變胞內輔酶Ⅰ與輔酶Ⅱ比例，使細胞代謝流發(fā)生變化，從而提高生物量或次級代謝產物[15]10。喻揚等[22]研究了在厭氧條件下將ORP值控制在-150 mV時對酵母發(fā)酵乙醇過程最為有利，說明可以利用氧化還原電極來精確控制厭氧發(fā)酵條件，為細胞合理分配代謝流以實現生物量或次級代謝產物的增加提供一種有效的監(jiān)控手段。此外，通過在發(fā)酵液中添加適量還原劑，如巰基乙酸(0.1%～0.2%)、抗壞血酸(0.1%)、硫化鈉(0.025%)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(0.05%)、還原性金屬除氧劑及通入惰性氣體(如氮氣)或加熱煮沸培養(yǎng)基等方法都可以實現降低培養(yǎng)基的ORP，創(chuàng)造利于丁酸梭菌大量繁殖生長的厭氧環(huán)境。邢宏觀等[7]選擇FeSO4作為除氧劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，當FeSO4添加量為1.2%時效果最佳，菌體數達到4.55×108CFU/mL，與對照組相比有顯著提高，同時還發(fā)現，當Mg2+添加量為2 mmol/L 時對丁酸梭菌的生長有明顯促進作用，Zn2+、Ca2+、Mn2+等金屬離子則對其生長有抑制作用，Cu2+完全抑制其生長，可能Zn2+、Mn2+、Fe2+等金屬離子是代謝通路中某些關鍵酶的輔因子，對酶活性起著重要調節(jié)作用。丁酸梭菌利用葡萄糖發(fā)酵過程中會產生“Crabtree效應”，能誘導菌體過早形成芽孢，細胞生長增殖周期縮短，大大降低發(fā)酵密度。Dubnau等[24]研究發(fā)現，3種蛋白復合體YlbF、YmcA和YaaT可加速SpoOA蛋白磷酸化形成二聚體，增強靶基因啟動子區(qū)域“OA-box”親和力，促進孢子及生物膜的形成。研究[25]表明，細胞中GTP水平與全局轉錄調控因子CodY表達有關。發(fā)酵過程中添加適量檸檬酸鈉可使CodY處于激活狀態(tài)，增加細胞中GTP水平，抑制芽孢過早形成，延長細胞的營養(yǎng)生長周期。Hakalehto等[26]發(fā)現，CO2是梭狀芽孢桿菌生長的一個必要信號，酸性條件下難以將CO2留在培養(yǎng)基中，當外部環(huán)境中缺少CO2時將導致丁酸梭菌生長延遲或生長難以啟動，可通過將丁酸梭菌與短乳桿菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，短乳桿菌產生的CO2能促進丁酸梭菌生長的啟動。

1. 甘油脫水酶 2. 1，3-丙二醇脫氫酶 3. 甘油脫氫酶(dhaD) 4. 二羥丙酮激酶(dhaK) 5. 磷酸己糖異構酶 6. 磷酸甘油異構酶 7. 烯醇化酶 8. 丙酮酸激酶 9. 丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶 10. 硫解酶 11. 三羥丁酰COA脫氫酶 12. 丁酰磷酸轉移酶 13. 丁酸激酶 14. 丁醛脫氫酶 15. 丁醇脫氫酶 16. 磷酸轉乙酸酶 17. 乙酸激酶 18. 乙醛還原酶 19. 乳酸脫氫酶 20. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 21. 檸檬酸合酶 22. 順烏頭酸梅 23. 檸檬酸脫氫酶 24. 蘋果酸脫氫酶 25. 延胡索酸酶 26. 延胡索酸酶還原酶 27. 氫化酶 28. 鐵氧還原蛋白-NAD(P)+還原酶 29. NAD(P)H-鐵氧還蛋白還原酶圖1 丁酸梭菌屬細菌的主要代謝途徑[13-14]Figure 1 Main metabolic pathways of Clostridium butyrate

2 丁酸梭菌高密度厭氧發(fā)酵方式

厭氧發(fā)酵(anaerobic fermentation)指厭氧環(huán)境下，通過微生物的代謝活動降解有機質，同時伴有CH4和CO2產生的過程。丁酸梭菌厭氧發(fā)酵一般可分為3種發(fā)酵方式：厭氧液態(tài)發(fā)酵(anaerobic liquid-state fermentation，ALF)、厭氧固態(tài)發(fā)酵(anaerobic solid-state fermentation，ASF)和厭氧混菌發(fā)酵(anaerobic co-culture fermentation，ACF)。

2.1 厭氧液態(tài)發(fā)酵

厭氧液態(tài)發(fā)酵(ALF)是指在生化反應器中，將細菌在生長發(fā)育過程中所必須的有機物、無機鹽等一些微量元素溶解在水中作為培養(yǎng)基，在厭氧環(huán)境下將液體中的有機物轉化為有機酸、二氧化碳等產物。液態(tài)發(fā)酵法可通過補料流加發(fā)酵培養(yǎng)基，既能提高整個培養(yǎng)體系pH值避免“酸脅迫效應”還可以補充新鮮營養(yǎng)物質維持菌體的持續(xù)生長[27]，從而提高細胞生物量。液態(tài)發(fā)酵法還能在菌體發(fā)酵至穩(wěn)定期時流加20%的碳酸鈉調節(jié)發(fā)酵液至pH 6.5以中和發(fā)酵過程中產生的有機酸，解除酸脅迫抑制，創(chuàng)造菌體適宜生長的環(huán)境[28]。邢宏觀等[7]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1%的輕質CaCO3，發(fā)酵后菌體數達到8.45×108CFU/mL。夏會麗等[20]研究發(fā)現，采用葡萄糖和乙醛共補料發(fā)酵策略，可以使NADH氧化合成途徑向支路遷移，降低有機酸的積累，使丁酸梭菌活菌數達到1.14×109CFU/mL。袁華偉等[29]也報道了用清液發(fā)酵丁酸梭菌，培養(yǎng)48 h后有效活菌數達到1.64×108CFU/mL；梁運祥等[30]采用清液發(fā)酵培養(yǎng)技術，向培養(yǎng)基中分段式流加碳源和金屬鹽，發(fā)酵后丁酸梭菌生物量達到2.30×109CFU/mL。液態(tài)厭氧發(fā)酵最大優(yōu)點就是可以進行清液發(fā)酵，對菌體的分離收集非常有利[31]，可以將菌體制成不同劑型藥物，適合于醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)，但應用于工業(yè)上生產飼料添加劑設備投入大，產出效率低，造成成本較高，不利于市場上的推廣與應用。

2.2 厭氧固態(tài)發(fā)酵

厭氧固態(tài)發(fā)酵(ASF)是指發(fā)酵體系在近乎無自由水存在的狀態(tài)下，厭氧微生物利用固體有機廢棄物為原料發(fā)酵產生小分子有機物和CH4、H2、CO2等氣體的過程。反應體系中總固體含量一般為20%～50%[32]，最高可達70%。

目前，雖然液態(tài)深層發(fā)酵技術已經比較成熟，但發(fā)酵丁酸梭菌所得菌體濃度仍普遍不高，大多數報道中所得發(fā)酵菌數一般在107～109CFU/mL，某些發(fā)酵活菌數較高的報道基本處于實驗室小規(guī)模試驗階段，而且所使用的培養(yǎng)基成分主要是牛肉膏、蛋白胨、酵母粉等營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，成本較高。此外，液體發(fā)酵還由于設備投入大、技術要求高等因素，無形中增加了工業(yè)化生產成本，從而使丁酸梭菌益生菌劑在飼料添加劑市場上的應用受到很大制約。固態(tài)發(fā)酵除具有設備簡單、操作方便等優(yōu)勢外[33]，還具有培養(yǎng)基原料來源廣泛、價格低廉，發(fā)酵后既能改善飼料風味、降低飼料中抗營養(yǎng)因子可直接飼養(yǎng)動物[34]，減少廢水排放等造成的環(huán)境污染問題。此外，丁酸梭菌作為畜禽腸道中土著菌群，其生存的環(huán)境為固態(tài)或半固態(tài)，所以采用丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵方法也許更適合其生長繁殖。王雪奇等[35]以添加碳酸鈣的大豆渣作為固態(tài)基質，用檸檬酸鈉—磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后兩歧雙歧桿菌活菌數可達1.60×109CFU/g；謝全喜等[36]用復合固態(tài)培養(yǎng)基豆粕∶麩皮=1∶1進行丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵，37 ℃培養(yǎng)72 h后活菌數可達2.20×108CFU/g；王海寬等[37]利用豆粕和米糠等作為復合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)40～55 h后，丁酸梭菌有效活菌數達到4.35×109CFU/g。

2.3 厭氧混菌發(fā)酵

厭氧混菌發(fā)酵(ACF)又叫共培養(yǎng)厭氧發(fā)酵，在培養(yǎng)基質中接入兩種或兩種以上不同菌種共同培養(yǎng)發(fā)酵。丁酸梭菌是嚴格厭氧菌，單菌發(fā)酵增加其對厭氧設備的需求且發(fā)酵初期啟動困難，雖然可以通過加大接種量使丁酸梭菌快速增殖以創(chuàng)造厭氧環(huán)境，但又會造成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量高、易染菌、后期干燥困難等問題。

很多研究表明，固態(tài)混菌發(fā)酵中，好氧菌或兼性厭氧菌的快速增殖可將共培養(yǎng)體系中的氧氣耗盡創(chuàng)造無氧環(huán)境，同時菌株間的相互協同作用能提高對底物的分解能力和利用率[38]，將大分子蛋白質降解為小肽，降低粗纖維含量[39]，促進丁酸梭菌快速生長增殖。此外，不同菌株共同發(fā)酵還可以節(jié)約資源和時間，降低發(fā)酵成本[1]，且發(fā)酵后固體培養(yǎng)基中次級代謝產物更加豐富、微生態(tài)體系更穩(wěn)定，適應性增強。王松麗等[40]利用CBS培養(yǎng)基對丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌進行了混合培養(yǎng)，結果顯示兩種菌按1∶1比例接種后于37 ℃條件下厭氧罐中共培養(yǎng)48 h后活菌數分別是6.30×108，4.35×109CFU/mL，較純培養(yǎng)生物量分別增加了80.0%，51.7%，顯示混菌發(fā)酵中兩種菌株相互促進生長。王海寬等[41]以35%～45%的酶解豆粕∶米糠=5∶1為固料，按其重量的10%接種丁酸梭菌和按其重量的2%接種凝結芽孢桿菌，在非厭氧條件下37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測得丁酸梭菌活菌數為2.70×108CFU/mL；在厭氧培養(yǎng)箱中用氮氣制造無氧環(huán)境，靜置培養(yǎng)40～55 h，最終活菌數高達4.35×109CFU/g。朱曉慧等[42]研究表明，在雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌中加入其體積1/3的丁酸梭菌發(fā)酵提取液室溫培養(yǎng)24 h后，3種菌有效活菌數分別增加了24%，43%，7%。張善亭等[43]利用優(yōu)化的復合固態(tài)培養(yǎng)基麩皮23.23%、玉米粉10%、米糠6.65%為基質，乳酸菌與丁酸梭菌1∶1比例混合接種后，37 ℃發(fā)酵48 h的活菌數分別大于5.0×108，2.0×109CFU/g。

3種發(fā)酵方式優(yōu)缺點見表1。

3 厭氧發(fā)酵生物反應器

生物反應器的作用是為微生物的正常生長繁殖與代謝提供一個適宜的環(huán)境，是微生物發(fā)酵工藝中一個重要因素和核心技術。由于厭氧微生物生理特殊性，厭氧發(fā)酵生物反應器智能化程度的高低也是限制其高密度發(fā)酵的關鍵因素之一。因此，研究厭氧發(fā)酵生物反應器對高密度厭氧發(fā)酵技術的發(fā)展具有重要意義[44]。目前，厭氧發(fā)酵生物反應器主要有兩大類[45]：實驗室規(guī)模(小試裝置)和工業(yè)化規(guī)模(中試裝置)。實驗室規(guī)模的反應器類型精小多樣，設計較復雜，多用于實驗室厭氧菌的小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；工業(yè)化規(guī)模則更偏重于工業(yè)化生產方向，反應器設計上簡便實用、智能化程度高，有較完備的監(jiān)測系統，能實時觀察和調節(jié)微生物的生長，但反應器類型基本相同，結構上沒有太多變化。

表1 丁酸梭菌厭氧發(fā)酵方式的比較Table 1 Comparison of the anaerobic fermentation method of clostridium butyricum

3.1 管式反應器

管式反應器是最原始、簡單的厭氧培養(yǎng)方法，適用于實驗室里丁酸梭菌的小規(guī)模厭氧培養(yǎng)。管式反應器有高層瓊脂柱法、Hungate滾管法等類型。高層瓊脂柱法，即將加有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管里培養(yǎng)厭氧菌。這種培養(yǎng)方法的特點是瓊脂柱越深，其氧化還原電勢越低，越有利于厭氧菌的生長。Hungate滾管法(hungate roll-tube technique)是利用除氧銅柱來制備高純氮，用高純氮驅除小環(huán)境中空氣，從而制造出高度無氧環(huán)境，保證嚴格厭氧菌的正常生長，滾管法的優(yōu)點在于試管口與空氣接觸面積小，滾動后試管內可培養(yǎng)表面積增大，可用于單菌落的計數觀察。Raimbault等[46]發(fā)明使用小圓管作為厭氧發(fā)酵反應器，該反應器利用恒溫水浴鍋控溫，但在發(fā)酵過程中不能在同一體系中連續(xù)取樣，每取一次樣品就浪費一支小圓管。Durand等[47]發(fā)明了管式可測反應器，該反應器與Raimbault的小圓管反應器相比，提高了反應器溫度的穩(wěn)定性和含水量測定的準確性。

3.2 轉鼓式反應器

轉鼓式反應器是一個多相反應系統，其基本構成由圓柱形反應容器、轉動軸系統、攪拌擋板等部分組成。轉鼓式反應器的特點適合于丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵，可在發(fā)酵過程中通入二氧化碳和氮氣等混合氣體降低發(fā)酵過程的氧化還原電位，溫度控制系統較完善。轉鼓式反應器在固態(tài)基質傳熱、傳質方面有較明顯的改善，但在發(fā)酵過程中反應器軸向基質的溫度梯度仍然很大，特別是丁酸梭菌發(fā)酵后期培養(yǎng)基質黏度增大，在反應器的轉動過程存在物料結塊和粘壁現象，造成傳質不均，易受污染，可通過增加破碎板(網)改善結塊問題，但仍有少許結塊存在。此外，反應器容積率低，在工業(yè)化放大生產過程中也存在一些困難。

3.3 滾筒式反應器

滾筒式生物反應器可以加快熱傳遞，消除溫度梯度，促進微生物正常生長繁殖，該反應器易于實現機械化操作和擴大規(guī)模化生產[48]。轉筒式生物反應器有密閉轉筒和多孔轉桶，與密閉轉筒相比，多空轉筒可將發(fā)酵過程產生的廢水及時排出，便于氣體流通且散熱效率提高。但此類生物反應器的缺點在于攪拌效率低，物料混合不均勻，對于黏度較大的培養(yǎng)基質攪拌過程易成團，不利于微生物的生長和發(fā)酵，且隨著生產規(guī)模的擴大換熱系統會出現很多問題[49]，因此，應用于丁酸梭菌發(fā)酵時應選擇不易發(fā)黏的培養(yǎng)基原料或增加破碎裝置減少物料成團現象。Wang等[50]利用5 t轉筒式厭氧發(fā)酵反應器以甜高粱為基質生產乙醇，該模型可以指導更大規(guī)模的轉筒式固態(tài)發(fā)酵罐研制和生產。Li等[51]報道了一種16 t連續(xù)轉筒固態(tài)發(fā)酵反應器，其最大的特點在于可連續(xù)生產。

3.4 攪拌槳式反應器

攪拌槳式反應器是工業(yè)化生產中應用最多也是智能化程度較高的一種生物反應器，既可用于丁酸梭菌的液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵也適用于混菌發(fā)酵，廣泛應用于各個發(fā)酵領域。

攪拌槳式反應器整體結構設計較為簡單，但不同攪拌槳形狀及槳葉間的不同組合在反應器內會產生不同的流體特征，直接影響到物料混合均勻程度、湍流能量耗散強度及溶氧濃度，流體混合不均一將造成物料的傳熱傳質過程分布不均一、發(fā)酵效率低[52]。因此，研究攪拌式反應器流體均一性混合是其設計及反應器放大的關鍵因素[53]。嚴玉平等[54]設計一種水平推流臥式厭氧發(fā)酵反應器，該反應器采用低轉速螺旋式攪拌，可實現物料的高濃度混合厭氧發(fā)酵，物料轉化率，達到50%～65%。Nagel等[55]研發(fā)出一種水平漿式攪拌反應器，該反應器極大提高了物料混合效率，改善了溫度和濕度的同步控制，利用反應器壁熱傳遞，但隨著攪拌速率的增加，機械攪拌產生大量熱量且易造成細胞損傷。

3.5 壓力脈動發(fā)酵反應器

壓力脈動發(fā)酵反應器主要是由空氣調節(jié)系統和發(fā)酵反應器兩部分組成，其主要是利用無菌空氣或無菌氮氣對密閉低壓反應器內氣相壓力施加周期性脈動，使發(fā)酵培養(yǎng)基間隙內的氣相傳質由分子擴散變?yōu)閺妼α鲾U散，泄壓后又因物料顆粒間氣相瞬間減小而膨脹，起到對固體顆粒松動作用[56]。壓力脈動反應器可適用于丁酸梭菌的厭氧固態(tài)發(fā)酵。

壓力脈動對于固態(tài)基質是靜態(tài)，但對于氣相而言是雙重動態(tài)，即壓力脈動和反應器內循環(huán)氣流運動[57]。利用壓力脈動產生的周期性氣體環(huán)流來翻動固態(tài)培養(yǎng)基質，可避免因機械翻動裝置密閉性不好等原因造成培養(yǎng)基污染，減少因攪拌作用使培養(yǎng)基質結塊，加快培養(yǎng)基間傳熱、傳質，還能周期性的刺激菌體生長[57]，提高生產效率。目前，壓力脈動發(fā)酵反應器已實現50，70 t等不同規(guī)模的工業(yè)化放大生產。

4 展望

丁酸梭菌屬于嚴格厭氧菌，其代謝通路中的丙酮酸—鐵氧還蛋白氧化還原酶對氧分子極為敏感，如何減少培養(yǎng)體系中氧氣含量，降低氧化還原電勢成為丁酸梭菌高密度發(fā)酵的重要因素。傳統清除發(fā)酵體系中氧氣的方法主要包括煮沸法、隔絕空氣法(覆蓋液體石蠟)、添加還原劑、通入氮氣等方法，這些方法都具有一定的局限性，在實際工業(yè)生產中操作復雜、僅適用于實驗室條件下的小規(guī)模發(fā)酵。丁酸梭菌3種厭氧發(fā)酵方式中，液態(tài)發(fā)酵更符合現代工業(yè)發(fā)酵趨勢，其優(yōu)點易于調控及工業(yè)化放大生產，通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化及發(fā)酵設備的改進有望實現高密度發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵方式更符合丁酸梭菌生長繁殖原生環(huán)境，配合混菌固態(tài)發(fā)酵技術可實現丁酸梭菌菌體的高密度增殖，但由于丁酸梭菌屬于嚴格厭氧菌，產品只適合在小范圍內銷售，相信隨著厭氧包裝與貯藏技術的發(fā)展及包裝成本的降低其銷售區(qū)域將更廣。通過對丁酸梭菌高密度發(fā)酵關鍵技術的研究，包括厭氧發(fā)酵方法、高密度發(fā)酵工藝及生物反應器的設計與改造等方面的研究將有助于實現丁酸梭菌高密度發(fā)酵的產業(yè)化，推動飼用丁酸梭菌在市場中的廣泛應用及無抗化養(yǎng)殖技術的發(fā)展。