維生素C與順鉑聯合用藥對人乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用及機制研究

祝連明，黃楠，孫愛華

(1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院藥劑科，杭州 310003； 2.浙江中醫藥大學醫學技術學院，杭州 310053；3.杭州醫學院基礎醫學與法醫學院，杭州 310053)

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，由于乳腺癌細胞連接松散，脫落后容易隨血液和淋巴液轉移，所以乳腺癌的一大特點為早期轉移[1-3]。維生素C是人體必需的維生素之一，人體不能自身合成，只能從體外攝取，其在維持機體的功能和物質代謝調節中起重要作用[4]。臨床上常將維生素C作為輔助性藥物，目前化療時也使用維生素C，但劑量一般較小。有學者認為，維生素C通過影響物質代謝和能量代謝達到抗腫瘤作用，但其抗腫瘤效果一直存在爭議[5-6]。近年有研究認為，靜脈注射大劑量的維生素C(每日10 g)對腫瘤治療有效[7-8]。順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，作為細胞周期非特異性藥物通過激活DNA損傷殺死細胞。目前，順鉑廣泛應用于膀胱癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種實體瘤的治療[9-11]。然而長期使用順鉑會產生不良反應和藥物耐受，因此尋找一種既可以保證化療療效又可以減少化療不良反應的藥物或藥物組合是抗腫瘤治療的研究方向之一[12]。MCF-7細胞是廣泛應用于乳腺癌發生、發展機制及治療實驗室研究的乳腺癌細胞系，本研究以MCF-7細胞為細胞模型，旨在探討維生素C與順鉑聯合用藥對人乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 人乳腺癌細胞MCF-7購自美國模式培養物集存庫。順鉑購自美國Sigma公司(批號：20170919)，維生素C注射液購自上海現代哈森藥業有限公司(批號:17051516)。四氮唑鹽比色法試劑盒由美國Thermo Fisher Scientific公司生產，FACSCalibur流式細胞儀由美國Becton,Dickinson and Company公司生產，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2細胞培養及檢測 將人乳腺癌細胞MCF-7置于含有10%胎牛血清的1640培養液37 ℃、5% CO2常規培養，培養條件為細胞鋪滿培養瓶80%時進行傳代。

1.2.1四氮唑鹽比色法檢測不同濃度的維生素C和(或)順鉑對MCF-7細胞增殖的抑制作用 將對數生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶溶液消化后吹打均勻并調整細胞濃度為1×105/mL，用微量加液器移取至96孔板，每孔加100 μL，37 ℃、5% CO2培養24 h。鏡下觀察細胞生長情況、形態學變化，若發現96孔培養板中細胞已經貼壁生長，且形態正常，分別加入維生素C和順鉑，使維生素C終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L，順鉑的終濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL；根據單獨用藥對細胞生長抑制率檢測結果確定維生素C和順鉑聯合用藥劑量，聯合用藥時維生素C的終濃度為1 mmol/L，順鉑的終濃度分別為 0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，組成8種組合。所有藥物抑制作用檢測實驗均以不加藥同期培養的細胞作為對照組，37 ℃、5% CO2培養48 h,同一藥物、同一濃度均重復3孔。鏡下觀察細胞生長情況、形態學變化，四氮唑鹽比色法檢測不同濃度的維生素C和(或)順鉑對細胞生長的抑制率，細胞生長抑制率=(1-實驗組OD均值/對照組OD均值)×100%，將MCF-7細胞抑制率為50%時維生素C和(或)順鉑的藥物濃度記為半數細胞抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)。

1.2.2流式細胞儀檢測不同濃度維生素C和(或)順鉑對MCF-7細胞凋亡的影響 將對數生長期的MCF-7細胞濃度調整為1×105/mL，接種于6孔板中，常規培養24 h后，根據藥物對MCF-7細胞的抑制作用結果，維生素C濃度分別選擇0、0.5、1、2 mmol/L，順鉑濃度分別為0、2.5、5 μg/mL，組成12種聯合用藥組合，同一藥物、同一濃度均重復3孔。37 ℃、5% CO2培養48 h后用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化，離心半徑8 cm、800 r/min、4 ℃離心10 min后收集細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3蛋白質印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白表達 分別選擇濃度為0、0.5、1、2 mmol/L的維生素C與5 μg/mL順鉑進行組合用藥確定順鉑單獨用藥或與維生素C聯合加入對數生長期的MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達，以不加藥同期培養的細胞作為對照組，37 ℃、5% CO2培養48 h，同一藥物、同一濃度均重復3孔。收集細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌2遍收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃、離心半徑8 cm、150 00 r/min離心5 min，取上清液加入裂解液置于冰上反應5 min，4 ℃、離心半徑8 cm、120 00 r/min離心10 min收集上清液即為蛋白，用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白[胱天蛋白酶3(caspase-3)和B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)]的表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，每孔加入各組收集蛋白10 μg，各組收集蛋白并進行電泳，半干法轉膜，5%脫脂奶粉液封閉1 h，分別加入相應一抗 (1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST(Tris-HCl緩沖鹽+吐溫)洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000 稀釋)，室溫孵育2 h，應用增強型化學發光顯色。美國伯樂凝膠圖像處理系統對結果進行掃描并分析。

2 結 果

2.1維生素C和(或)順鉑對MCF-7細胞增殖的抑制作用 維生素C、順鉑單獨用藥和1 mmol/L 維生素C和順鉑聯合用藥的MCF-7細胞增殖抑制率比較差異均有統計學意義(P<0.05)。低濃度維生素C(≤1 mmol/L)對乳腺癌細胞MCF-7增殖的抑制作用小，濃度升高>1 mmol/L時，其對乳腺癌細胞MCF-7增殖的抑制率明顯提高，且隨著維生素C濃度升高抑制率增加，維生素C對MCF-7細胞的IC50為2.84 mmol/L。順鉑單獨用藥對乳腺癌細胞MCF-7增殖的抑制作用隨藥物濃度升高而增加，IC50為4.89 μg/mL。1 mmol/L的維生素C和不同濃度順鉑聯合用藥對乳腺癌細胞增殖的抑制作用隨順鉑濃度升高而增加，IC50為2.14 μg/mL。維生素C和順鉑聯合用藥對MCF-7細胞增殖的抑制率明顯高于維生素C或順鉑單獨用藥(P<0.05)。濃度≥1.25 μg/mL的順鉑和 1 mmol/L的維生素C聯合用藥對MCF-7細胞增殖的抑制率均明顯高于順鉑單獨用藥(P<0.05)。按金氏公式計算q值均>1.15，提示1 mmol/L的維生素C與1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL 和10 μg/mL的順鉑有協同效應，增加了順鉑的敏感性。見表1。

2.2維生素C和(或)順鉑對MCF-7細胞凋亡的影響 維生素C與順鉑聯合用藥的MCF-7細胞凋亡率明顯高于維生素C或順鉑單獨用藥(P<0.05)。對于維生素C用藥組，0.5 mmol/L的維生素C與對照組的MCF-7細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)；1 mmol/L和2 mmol/L的維生素C對MCF-7細胞的凋亡率明顯高于對照組(均P<0.05)。對于順鉑用藥組，2.5 μg/mL和5.0 μg/mL順鉑對MCF-7細胞的凋亡率明顯高于對照組(均P<0.05)。所有單獨用藥高劑量組的MCF-7細胞凋亡率均明顯高于對應低劑量組(P<0.05)；所有聯合用藥組的MCF-7細胞凋亡率均明顯高于單獨用藥(P<0.05)；所有聯合用藥高劑量組的MCF-7細胞凋亡率均明顯高于對應低劑量組(P<0.05)。維生素C和順鉑單獨用藥或聯合用藥的MCF-7細胞凋亡率比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

維生素C抑制率順鉑抑制率維生素C+順鉑抑制率0.125 mmol/L1.87±0.430.312 5 μg/mL7.76±3.571 mmol/L+0.312 5 μg/mL11.89±3.860.25 mmol/L2.21±0.510.625 μg/mL14.76±4.801 mmol/L+0.625 μg/mL21.46±6.390.5 mmol/L2.87±0.471.25 μg/mL29.24±5.831 mmol/L+1.25 μg/mL46.17±5.781 mmol/L4.06±0.612.5 μg/mL39.82±4.471 mmol/L+2.5 μg/mL58.11±5.092 mmol/L42.51±2.415 μg/mL51.28±5.741 mmol/L+5 μg/mL70.88±6.314 mmol/L59.72±3.3010 μg/mL63.86±6.021 mmol/L+10 μg/mL84.10±6.378 mmol/L66.44±2.8720 μg/mL70.97±5.361 mmol/L+20 μg/mL90.12±4.5016 mmol/L74.93±2.4540 μg/mL78.56±5.091 mmol/L+40 μg/mL90.25±5.02F值17.837F值23.514F值42.906P值0.003P值0.003P值0.001

維生素C順鉑0 μg/mL2.5 μg/mL5.0 μg/mL0 mmol/L7.21±2.9015.47±3.40a29.68±3.08ab0.5 mmol/L10.45±3.2727.09±3.67ac41.55±4.07acd1 mmol/L 31.30±4.98ab40.66±4.02acd68.21±4.63acd2 mmol/L53.98±4.99ab68.40±4.51acd85.83±5.77acdF值16.94518.78733.200P值0.0030.0030.001

a與對照組比較，P<0.05；b與單獨用藥對應低劑量組比較，P<0.05；c與單獨用藥組比較，P<0.05；d與聯合用藥對應低劑量組比較，P<0.05

2.3蛋白質印跡法檢測結果 與5 μg/mL順鉑單獨用藥相比，順鉑與維生素C聯合用藥的caspase-3表達量升高和Bcl-2表達下降(均P<0.05)。與對照組相比，5 μg/mL順鉑單獨用藥或與0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L 維生素C聯合用藥后MCF-7細胞促凋亡蛋白caspase-3的表達增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達減少；且1 mmol/L和2 mmol/L 維生素C與5 μg/mL順鉑聯合用藥的caspase-3表達明顯高于順鉑單獨用藥(均P<0.05)，而Bcl-2的表達明顯低于5 μg/mL順鉑單獨用藥(均P<0.05)。以GAPDH為內參，利用美國伯樂凝膠圖像處理系統對結果進行掃描并分析，caspase-3和Bcl-2的表達與內參比值(Bcl-2/GAPDH)，見圖1和表3。

3 討 論

維生素C在腫瘤治療中的作用廣泛。研究認為，維生素C對腫瘤具有治療作用[5-8]，但有研究認為維生素C不能抑制惡性腫瘤進展，延長患者生存時間[13]。近年有學者發現，維生素C對腫瘤的治療作用與血藥濃度相關，高劑量維生素C對癌細胞具有殺傷作用[7,14]。另外，有學者在研究維生素C的抗腫瘤機制時發現維生素C可通過協同效應增敏其他抗腫瘤藥物[15-16]。本研究分析0.125～16 mmol/L倍比遞增維生素C濃度對乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用，發現低濃度維生素C(≤1 mmol/L)對MCF-7細胞的抑制率(≤2.23%)低，而維生素C濃度>1 mmol/L時，其對MCF-7細胞的抑制率顯著上升且呈濃度依賴性，提示維生素C對癌細胞的殺傷作用與濃度相關，只有達到一定的細胞濃度才能有效抑制細胞增殖，表明在維生素C治療腫瘤時應考慮維生素C在消化道的吸收率，以保證細胞藥物濃度，故建議注射用藥，這與劉珊和韓艷秋[17]對維生素C對順鉑治療大鼠卵巢癌療效的影響研究結果一致。然而在腫瘤治療中，無論是維生素C還是本研究用的腫瘤治療經典藥物順鉑均有不良反應，特別是高劑量時不良反應尤為明顯[18]。本研究結果顯示，1 mmol/L 維生素C與不同濃度順鉑聯合用藥對MCF-7的抑制率均高于同濃度順鉑單獨用藥，其中順鉑單獨用藥對乳腺癌細胞MCF-7增殖的IC50為4.89 μg/mL，當順鉑與1 mmol/L的維生素C聯合用藥后IC50為2.14 μg/mL，而1 mmol/L 維生素C對MCF-7細胞增殖的抑制率僅為2.23%，1 mmol/L 維生素C與較低濃度的順鉑聯合能起到很好的腫瘤殺傷作用，且不良反應較少,提示1 mmol/L的維生素C對較低濃度的順鉑有協同增敏效應。

VitC：維生素C；Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；caspase-3：胱天蛋白酶3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖1順鉑單獨用藥或聯用不同濃度維生素C后MCF-7細胞caspase-3和Bcl-2的表達

組別caspase-3/GAPDHBcl-2/GAPDH對照組10.52±1.01230.29±14.205 μg/mL順鉑80.78±5.67a157.34±10.49a5 μg/mL順鉑+0.5 mmol/L 維生素C111.58±8.51a124.89±8.94a5 μg/mL順鉑+1 mmol/L 維生素C176.04±10.61ab74.71±5.62ab5 μg/mL順鉑+2 mmol/L 維生素C240.12±12.07ab20.80±4.10abF值87.96793.221P值<0.001<0.001

caspase-3：胱天蛋白酶3；Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；a與對照組比較，P<0.05；b與5 μg/mL順鉑單獨用藥比較，P<0.05

細胞增殖和凋亡均是復雜的多基因調控過程，它們同時受到各種原癌基因及抑癌基因的雙向調控[19]。其中，Bcl-2是常見的抑制凋亡基因，有延長細胞生存周期的作用，還可作用于線粒體通過抑制促凋亡蛋白發揮作用；caspase-3是細胞凋亡最關鍵的酶，可促進凋亡[20-21]。本研究結果顯示，5 μg/mL順鉑或5 μg/mL 順鉑與不同濃度維生素C聯合作用對MCF-7細胞的凋亡率明顯高于對照組；維生素C的濃度為1 mmol/L時，其與5 μg/mL順鉑聯合用藥對MCF-7細胞的凋亡率明顯高于5 μg/mL順鉑單獨用藥。提示，Bcl-2和caspase-3與5 μg/mL順鉑單獨用藥或與維生素C聯合用藥促進MCF-7細胞的凋亡作用，其機制可能是通過抑制Bcl-2的表達和促進caspase-3的表達發揮促MCF-7細胞凋亡作用。

綜上所述，維生素C和(或)順鉑可抑制MCF-7細胞增殖并促進其凋亡，且聯合用藥效果優于單獨用藥。1 mmol/L的維生素C對順鉑抑制MCF-7細胞增殖有增敏作用，順鉑誘導細胞凋亡的機制可能是通過促進caspase-3和抑制Bcl-2的表達實現。