1,25-二羥維生素D3對小鼠急性結腸炎模型的干預研究

陳穎，周仁民，陳欣濤，林瓊

(無錫市兒童醫院消化科，江蘇 無錫 214000)

炎癥性腸病是一種非特異性腸道炎癥性疾病，近年來兒童炎癥性腸病發病率逐年升高，其特異性致病因素和發病機制尚不十分清楚，目前認為與多種因素有關，免疫紊亂可能是其致病的基礎機制[1-2]。1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3]是機體免疫系統的調節因子，在多種自身免疫性疾病中通過與維生素D受體(nuclear receptor vitamin D receptor，VDR)結合發揮調節作用[3-4]。炎癥性腸病患者和小鼠模型血清中1,25(OH)2D3水平較低[5-6]。將小鼠的VDR基因敲除，可以誘導結腸炎的發生，而在補充1,25(OH)2D3后結腸炎癥得到明顯改善[7]。大多數研究認為，成人炎癥性腸病患者補充維生素D是必要的，也有部分研究不支持這一觀點[8-9]。在兒童炎癥性腸病患者中，維生素D缺乏更為明顯，但現有研究對于維生素D能否作為治療手段仍不明確[10]。

炎癥性腸病患者及小鼠模型中均有腸黏膜凋亡增多[5-6]，而Bax和Bcl-2是重要凋亡調控基因，胱天蛋白酶3(caspase-3)是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。研究發現，在人腎小球系膜細胞中，1,25(OH)2D3能夠改善系膜細胞凋亡并促進caspase-3表達[11-12]。本研究進一步證實1,25(OH)2D3在小鼠急性腸炎中的治療作用，探討其可能的作用機制，以期為炎癥性腸病的臨床治療提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1材料 選取6～8周齡清潔級BALB/c雄性小鼠24只，體重18～22 g，購自江蘇亞東實驗動物研究院有限公司[生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0009]。飼養溫度控制在18～22 ℃，濕度50%～60%。主要試劑：右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)(美國Sigma公司)；維生素D3(羅蓋全膠囊，上海羅氏制藥有限公司生產)；核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)單克隆抗體、caspase-3多克隆抗體均購自美國CST公司；GTVisionTM抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒購自南京貝斯特生物技術有限公司。主要儀器：離心機(美國Beckman公司)；組織切片機(德國徠卡)；光學顯微鏡(美國Olympus公司)等。

1.2小鼠模型及分組 24只小鼠編號后按隨機數字法分為對照組、模型組、干預組，每組8只。維生素D3是按照成人維生素D缺乏的常規劑量給藥(50 000 IU/周)，按體表面積折算為小鼠的等效劑量，采用該劑量的5倍作為本實驗的干預劑量。根據Cooper等[13]的經典方法，對照組小鼠自由飲用蒸餾水7 d；模型組和干預組小鼠自由飲用 3% DSS溶液7 d建立小鼠急性結腸炎模型。同時，于第 1、3、5、7 天行灌胃，對照組和模型組小鼠予無菌磷酸鹽緩沖液灌胃，干預組小鼠予維生素D3灌胃。每天觀察并記錄小鼠體重、大便、活動、飲食、存活等情況。造模10 d后，處死各組小鼠，采集小鼠結腸標本備檢。

1.3疾病活動指數(disease activity index，DAI) 每日觀察小鼠體重、大便性狀和隱血或血便情況，計算DAI評分。DAI結合患者(患病動物)的體重下降百分率(體重不變為0，1%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～15%為3分，>15%為4分)、大便黏稠度(正常為0，松散的大便為2分，腹瀉為4分)和大便出血(正常0分，隱血陽性為2分，肉眼血便為4分)三種情況進行綜合評分。DAI=(體重下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3[13]。

1.4結腸組織病理學評分 取遠端結腸組織，石蠟包埋的腸組織分別做5 μm連續切片，按照二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、自來水沖洗1 min、蘇木精染色7 min、自來水沖洗2 min、1%鹽酸乙醇2 s、自來水沖洗2 min、1%氨水30 s、自來水沖洗4 min、0.5%伊紅乙醇30 s、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片順序行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，根據表1進行組織病理學評分[13]。

1.5采用逆轉錄-聚合酶鏈反應測定小鼠遠端結腸組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達情況 應用RNAiso Plus總RNA提取試劑盒提取標本總RNA，并測定其濃度后-80 ℃保存備用。逆轉錄按照PrimeScriptTMRT reagent試劑盒進行逆轉錄-聚合酶鏈反應，以肌動蛋白(β-actin)為內參并檢測TNF-α的相對表達水平。引物設計如下。TNF-α上游引物：ACTCCAGGCGGTGCCTATGT，TNF-α 下游引物：GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA；β-actin上游引物：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC，β-actin 下游引物：ATGGAGCCACCGATCCACA，聚合酶鏈反應總反應體系為20 μL，置入聚合酶鏈反應儀中，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，4 ℃終止反應。

表1 結腸組織病理評分

1.6采用免疫組織化學法測定結腸組織中NF-κB、 caspase-3的表達情況 將石蠟包埋組織連續切片后，依次行脫蠟、 水化、3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液沖洗，微波爐內行抗原修復，再滴加山羊血清封閉液，一抗后4 ℃過夜，二抗、 三抗室溫各孵育30 min，正置顯微鏡下二氨基聯苯胺顯色 2 min后，行復染、脫水、透明，封片鏡檢。采用半定量法分別判斷NF-κB、caspase-3陽性結果。首先，判斷陽性細胞百分比：無陽性細胞記0分，1%～10%記1分，11%～50%記 2分，51%～80%記 3分，>80%記4分；再判定染色強度，根據陰性、弱、中、強分別記0、1、2、3分；最終評分為陽性細胞百分比和染色強度的乘積。

2 結 果

2.1各組小鼠的一般狀況 研究期間，對照組小鼠大小便正常、體重持續增加、毛發有光澤，飲食、活動等正常。模型組小鼠造模后第1天，體重增長，進食進水較多；造模后第3天體重逐漸下降、進食進水量逐漸減少，大便松散逐漸呈稀便，第5天后肛周可見肉眼血便。干預組小鼠造模后癥狀同模型組，但灌胃干預后，體重逐漸升高，進食進水量逐漸增加，大便量增加。

2.21,25(OH)2D3改善DAI及結腸長度 模型組與干預組小鼠DAI均高于對照組(Z=-2.498，P=0.013;Z=-2.400,P=0.016)，而干預組與模型組比較差異無統計學意義(Z=-0.369，P=0.712)。模型組、干預組結腸長度短于對照組(t=21.176，9.954，均P<0.01)，而干預組小鼠結腸長度長于模型組(t=16.088，P<0.01)，見表2。三組小鼠結腸長度測量結果見圖1。

表2 各組小鼠DAI及結腸長度比較

DAI:疾病活動指數；a與對照組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

圖1 對照組(1a)、模型組(1b)及干預組(1c)小鼠結腸長度

2.31,25(OH)2D3改善結腸組織病理損傷 對照組鏡下結腸組織結構基本正常，模型組小鼠顯示結腸結構紊亂，包括炎癥細胞浸潤、腺體萎縮，部分可見淋巴濾泡形成等，見圖2。干預組小鼠結腸病理損傷較模型組改善，干預組與模型組小鼠組織病理評分分別為(17.75±2.87)分、(15.00±2.62)分，差異無統計學意義(t=2.004，P=0.065)。

2.41,25(OH)2D3對結腸組織中TNF-α表達的影響 對照組、模型組及干預組TNF-α mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、2.85±0.08、2.74±0.06，三組間比較差異有統計學意義(F=989.112，P<0.01)，模型組及干預組TNF-α mRNA表達水平顯著高于對照組(t=39.147、54.129，均P<0.01)，而干預組TNF-α mRNA表達與模型組比較差異無統計學意義(t=1.925，P=0.127)。

圖2 對照組(2a)、模型組(2b)及干預組(2c)小鼠結腸組織病理結果圖像(HE ×200)

2.51,25(OH)2D3對凋亡途徑的影響 模型組與干預組小鼠結腸組織NF-κB p65表達均高于對照組小鼠(Z=-3.489，-3.491，P均<0.01)，而干預組和模型組比較差異無統計學意義(Z=-1.489，P=0.138)。模型組和干預組caspase-3高于對照組(Z=-3.475，-3.491，均P<0.01)，而干預組與模型組比較差異無統計學意義(Z=-1.560，P=0.119)。見表3。 NF-κB p65、caspase-3在對照組結腸組織內無表達，兩者在模型組和干預組黏膜層、黏膜下層腺體內及其炎癥細胞中均有表達，但兩者在干預組中表達較模型組低，見圖3。

3 討 論

約1/4的炎癥性腸病患者在20歲前被診斷[14]。兒童炎癥性腸病的發生率逐年升高，其腸道外并發癥、營養不良等發生風險較成人更為顯著。研究發現，炎癥性腸病患者存在不同程度的維生素D缺乏，在兒童炎癥性腸病患者中更為明顯。額外補充維生素D能否作為一種新的治療手段仍不確定。DSS誘導的結腸炎小鼠模型與人類潰瘍性結腸炎患者臨床表現及組織病理損傷類似，包括食欲下降、體重減輕、腹瀉、便血、炎癥細胞浸潤、腺體萎縮等[15-16]。因此，本研究利用DSS結腸炎小鼠作為研究模型。

表3 各組小鼠結腸組織內NF-κB p65、caspase-3相對表達水平比較 [M(P25，P75)]

NF-κB：核因子κB；caspase-3：胱天蛋白酶3；a與對照組比較，P<0.05

對照組 模型組 干預組

NF-κB：核因子κB；caspase-3：胱天蛋白酶3

圖3 對照組、干預組及模型組小鼠NF-κB p65、caspase-3表達圖像(HE ×200)

本研究結果顯示,模型組和干預組DAI高于對照組，與既往研究一致[17]。對比結腸長度，模型組較對照組顯著縮短，而干預組較模型組改善。本研究通過HE染色鏡檢發現，模型組結腸組織病理可見炎癥細胞浸潤、腺體萎縮，部分可見淋巴濾泡形成等，干預組和模型組組織病理評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此，建模成功。同時，本研究結果提示，干預組結腸組織也可見結腸炎表現，但嚴重程度較模型組低，與之前的研究一致[18]，表明1,25(OH)2D3可以改善DSS誘導的結腸炎小鼠DAI及結腸組織病理炎癥表現。

1,25(OH)2D3是維生素D的活性形式，具有免疫調節特性，對自身免疫性疾病發生及治療具有潛在作用。VDR是介導1,25(OH)2D3發揮生物效應的核內生物大分子，其在腸道組織內廣泛表達。既往研究著重于維生素D/VDR信號通路在炎癥性腸病動物模型中免疫調節機制，也有研究表明，維生素D/VDR信號通路可以通過非免疫機制調節炎癥性腸病[7-8]。NF-κB信號通路可以調控多種細胞因子、轉錄因子等基因的表達，參與免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡等多種生物進程，其也是腸道炎癥反應的重要信號通路之一。在實驗性小鼠模型中發現，NF-κB 可以調節多種促炎因子與抗炎因子表達，如TNF-α、白細胞介素-4、白細胞介素-6、白細胞介素-10、環加氧酶-2等，調節局部免疫反應，最終導致結腸黏膜損傷[14-20]。本研究結果顯示，1,25(OH)2D3可顯著降低局部TNF-α mRNA表達，減輕腸道炎癥反應，與既往研究結果一致[16]。VDR與NF-κB p65結合可以阻止其發生核轉移，阻斷NF-κB信號途徑，抑制后續級聯反應的發生。VDR在腸上皮細胞上表達減少導致NF-κB信號途徑的表達增加，從而促進促炎因子的表達。本研究中，模型組NF-κB p65蛋白表達較對照組升高，而干預組較模型組表達降低，表明1,25(OH)2D3可以通過結腸組織內NF-κB信號通路系統調節腸道內炎癥反應。故推測1,25(OH)2D3可以通過NF-κB信號通路調節炎癥因子平衡，改善結腸炎癥。

炎癥性腸病患者及小鼠模型中均發現結腸細胞凋亡表達增加，從而導致腸黏膜損傷。腸上皮細胞凋亡使腸上皮屏障受損及腸道損傷。Bax和Bcl-2是B細胞淋巴瘤2家族成員，在細胞凋亡中具有重要作用。Bax是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bcl-2位于線粒體外膜，可競爭性與Bax蛋白結合，形成Bax/Bcl-2二聚體，從而終止凋亡的發生。Bax/Bcl-2比率增加可以促進線粒體內細胞色素C釋放進入細胞質。正常情況下，細胞質內caspase-3以無活性酶原形式存在，細胞凋亡信號可以導致其發生裂解而活化，活化后的caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，而細胞色素C能促進caspase-3活化，進而發生下游級聯反應，使凋亡發生。本研究顯示，1,25(OH)2D3下調caspase-3表達，提示1,25(OH)2D3可以改善DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織細胞凋亡的發生。有研究表明，抑制結腸上皮細胞凋亡及NF-κB信號通路激活可能是1,25(OH)2D3抑制結腸炎癥的機制之一[21]。

綜上所述，急性結腸炎模型小鼠給予1,25(OH)2D3可顯著改善DAI、結腸長度及炎癥反應，減輕腸道損傷，并抑制結腸上皮細胞凋亡及NF-κB信號通路相關蛋白的表達，對急性結腸炎小鼠具有較好的干預效果。