蟲草益腎方對單側輸尿管梗阻大鼠Wnt/β聯蛋白信號通路影響的實驗研究

馬曉鵬，宋立群，楊紅利，周琪，李佳琦，范楨亮，贠捷，宋業旭

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院腎病科，哈爾濱150040； 2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040)

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是由多種原發性或繼發性腎臟疾病導致的慢性腎臟疾病。自2002年美國腎臟病及透析臨床實踐指南提出CKD的理念及定義后，十余年內CKD發病率不斷增加，已成為一種嚴重威脅人類健康的慢性疾病。腎間質纖維化是CKD進展至終末期腎臟病的病理表現和途徑。既往研究證明，腎間質纖維化是一個涉及氧化應激、炎癥反應以及與轉化生長因子-β/Smad和Wnt/β聯蛋白(β-catenin)等多條細胞信號通路密切相關的病理變化[1]。其中Wnt/β-catenin信號通路是近年來研究較為廣泛的一個細胞信號通路，研究發現其在糖尿病腎病、梗阻性腎病和多囊腎中均有明顯活化[2]。進一步研究發現Wnt/β-catenin信號通路在急性和慢性腎損傷中發揮截然不同的作用，表明可能成為干預腎間質纖維化的新的重要靶點[3]。

蟲草益腎方是宋立群教授根據多年臨床及科研工作擬定的經驗方，前期已有大量臨床和動物研究證明蟲草益腎方在防治腎間質纖維化中具有多靶點、多環節、多角度的優勢。蟲草益腎方可以通過調節核因子κB及相關細胞因子的表達延緩CKD進展，抑制腎間質纖維化[4]。本課題旨在分析蟲草益腎方對Wnt/β-catenin信號通路的干預作用及與福辛普利作用靶點的差異，探究其與藥效的關系，從而闡明蟲草益腎方多途徑、多靶點防治腎間質纖維化的優勢。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重180～200 g，平均(200±20) g，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(黑)2013-012]，飼養于臨床分子生物學實驗室(中醫管理局Ⅲ級重點實驗室)，飼養環境保持濕度40%～70%，溫度恒定在(22±2) ℃，給予實驗大鼠12/12 h晝夜循環。

1.1.2藥品與試劑 中藥飲片(黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草)購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院。冬蟲夏草菌絲粉由江西濟民可信集團提供(批號：180521)。福辛普利(商品名：蒙諾)購自中美上海施貴寶制藥有限公司(批號：P2018627151130753)。

肌酐(SBJ-R0120)、尿素氮(SBJ-R0119)、尿蛋白(SBJ-R1384)檢測試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司；蘇木精購自上海標本模型廠(329D0312)；兔Wnt4(K005478P)、Wnt5a(BA23921)、基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)(K001731P)多克隆抗體購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器設備 PL602-S精密電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；日立-7170A型自動生化分析儀(日本日立公司)；HZS-HA水浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；電泳儀、電泳槽及凝膠成像分析系統[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1動物分組 將50只Wistar大鼠根據隨機數字法分為空白組10只，假手術組10只，以及造模組30只。造模組在建立單側輸尿管梗阻模型后再隨機分為模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組，每組10只。

1.2.2單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型建立 大鼠適應性喂養1周后進行手術造模，于造模前24 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉。常規固定麻醉后的大鼠，備皮、消毒、鋪巾，于大鼠左側腹腎區切口，鈍性分離左側輸尿管，用4-0手術線，在腎盞處和腎下極處分別結扎并離斷輸尿管。手術后將腎臟置于原位，局部給予適量的注射用青霉素，逐層縫合肌肉與皮膚，手術切口處?？瞻捉M不做任何處理，假手術組僅游離左腎輸尿管，但不結扎離斷。

1.2.3藥物制備 將黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草混合后用冷水浸泡2 h，每次煎煮40 min，煎煮2次后將得到水煎液混合，使用旋轉蒸發儀將水煎液濃縮成含生藥0.657 g/mL的濃縮液，密閉避光保存于4 ℃冰箱中，保質期3 d。福辛普利用無菌注射用水配置成0.09 mg/mL的水溶液，密閉避光保存于4 ℃冰箱中，給藥當日現配現用。

1.2.4給藥方法 造模組術后第1天開始給予灌胃治療，其中蟲草益腎方組大鼠給予10 mL/kg蟲草益腎方水煎液灌胃，福辛普利組給予10 mL/kg福辛普利水溶液灌胃，空白組、假手術組和模型組給予同體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續給藥28 d。

1.2.5樣本采集 于給藥后的第27天灌胃后將各組大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，記錄尿量，用于24 h尿蛋白定量測定。第28天給藥后2 h，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠。常規固定麻醉后的大鼠，備皮、消毒、鋪巾，腹部正中線行縱向切口，暴露大鼠下腔靜脈。采集下腔靜脈血5 mL，相對離心力29 200×g,離心10 min分離血清，用于肌酐、尿素氮檢測。隨后游離大鼠雙側腎臟，稱取腎臟重量后將梗阻側腎組織沿腎門部切成兩部分，上部腎組織用于腎間質纖維化的病理學檢測(蘇木精-伊紅染色與Masson染色)，中部及下部腎組織采用Western blot檢測相關分子生物學指標(Wnt4、Wnt5a以及MMP-7)。

1.2.6腎組織形態學觀察 腎組織采用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm 厚切片，中性樹膠封片，并行蘇木精-伊紅染色與Masson染色。Masson染色在200倍光鏡下觀察腎間質膠原纖維染色，每組選取10張切片，每張切片選取不重復的10個視野。借助HMIAS-2000系統計算纖維化面積占整個視野腎間質面積的百分比(排除腎血管、腎小球、腎小管所占面積)。

1.2.724 h尿蛋白定量與腎功能檢測 采用日立-7170A型自動生化分析儀進行24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮的檢測。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 細胞裂解液(磷酸鹽緩沖溶液∶乙二胺四乙酸∶蛋白酶抑制劑=100∶1∶1)提取腎組織總蛋白，將混合液置于冰上，勻漿。勻漿后在冰上靜置30 min，相對離心力29 200×g，離心15 min后取上清液。二喹啉加酸法測定蛋白濃度，根據蛋白marker位置切下目的蛋白所在的聚丙烯酰胺凝膠電泳；將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜后，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次，每次5 min。室溫下二抗孵育1 h，化學發光成像儀中顯影。目的蛋白與內參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1腎組織外觀 造模時肉眼觀察各個大鼠雙側腎臟，空白組、假手術組、模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組并未發現肉眼可見的差異。第28天取材時發現模型組結扎側腎臟均較對側腎臟明顯腫大，顏色呈暗紅色或紫紅色，腎盂、腎盞擴張。切開腎臟后發現腎盂積水，腎盂內可見大量淡黃色或暗紫色膠凍樣血塊，腎皮質變薄。蟲草益腎方組與福辛普利組大鼠也均可見上述典型表現，但較模型組輕，空白組與假手術組均未見上述表現。說明造模時已順利結扎了左輸尿管，所有大鼠均成功建立UUO大鼠模型，見圖1。

2.2腎組織形態學觀察 顯微鏡下觀察空白組和假手術組大鼠腎組織，未見明顯的病理改變，腎間質無炎癥細胞浸潤及纖維組織形成。模型組造模后28 d發現大部分腎小球硬化壞死，腎小管重度擴張或萎縮，間質大面積炎癥細胞浸潤。可見間質局灶性出血，局灶腎小管上皮細胞脫落，部分小管腔內可見紅細胞管型和透明管型，腎間質纖維化，幾乎觀察不到正常腎組織。蟲草益腎組和福辛普利組大鼠的腎組織也可見明顯的腎小管擴張，間質炎癥細胞浸潤，紅細胞管型和透明管型，腎間質纖維化與腎小球硬化，但程度明顯較模型組輕微，見圖2。

1a：正常大鼠雙腎； 1b：UUO大鼠雙腎； 1c：UUO大鼠雙腎剖面; UUO：單側輸尿管梗阻

HE：蘇木精-伊紅

2.3各組大鼠腎組織纖維化水平比較 各組大鼠纖維化面積比較差異有統計學意義(P<0.01)，模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組腎間質纖維化面積大于空白組和假手術組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組小于模型組(P<0.05)，假手術組與空白組腎間質纖維化面積比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別只數腎纖維化面積空白組102.19±0.21假手術組102.20±0.26模型組1050.31±3.54ab蟲草益腎方組1043.57±2.11abc福辛普利組1046.76±4.10abcF值891.684P值<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05

2.4理化指標

2.4.1各組大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白定量比較 第28天時，各組大鼠24 h尿量與24 h尿蛋白定量比較差異有統計學意義(P<0.01)。模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組24 h尿量低于空白組、假手術組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組高于模型組(P<0.05)，福辛普利組高于蟲草益腎方組(P<0.05)，空白組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組24 h尿蛋白定量高于空白組、假手術組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組低于模型組(P<0.05)，福辛普利組高于蟲草益腎方組(P<0.05)，空白組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4.2各組大鼠血尿素氮與血肌酐比較 第28天時，各組大鼠血尿素氮與血肌酐比較差異有統計學意義(P<0.01)。模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組血尿素氮、血肌酐水平均高于空白組和假手術組(P<0.05)，蟲草益腎方組血尿素氮低于模型組(P<0.05)，蟲草益腎方組和福辛普利組血肌酐低于模型組(P<0.05)，空白組與假手術組血尿素氮與血肌酐水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別只數24 h尿量(mL)24 h尿蛋白定量(g)空白組1018.18±2.702.04±0.20假手術組1018.91±1.711.98±0.24模型組108.15±1.39ab10.24±1.34ab蟲草益腎方組1013.16±3.59abc4.49±1.34abc福辛普利組1014.82±2.74abc5.87±0.54abcdF值28.815234.875P值<0.001<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05；d與蟲草益腎方組比較，P<0.05

組別只數血尿素氮(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白組105.45±0.5530.09±4.67假手術組105.96±2.8427.44±5.05模型組1013.26±1.91ab72.94±5.48ab蟲草益腎方組109.50±2.78abc49.93±6.85abc福辛普利組1011.31±1.91ab62.97±3.01abcdF值24.312149.098P值<0.001<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05；d與蟲草益腎方組比較，P<0.05

2.4.3各組大鼠腎組織Wnt4、Wnt5a和MMP-7水平比較 第28天時各組大鼠腎組織Wnt4、Wnt5a和MMP-7表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。模型組Wnt4表達水平高于空白組和假手術組(P<0.05)，福辛普利組高于假手術組(P<0.05)，蟲草益腎方與福辛普利組均低于模型組(P<0.05)，空白組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組Wnt5a、MMP-7高于空白組和假手術組，蟲草益腎方組和福辛普利組低于模型組(P<0.05)，空白組和假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖3。

組別只數Wnt4Wnt5aMMP-7空白組100.229±0.0280.496±0.0490.016±0.002假手術組100.158±0.0150.307±0.0730.016±0.006模型組101.738±0.793ab6.660±0.363ab4.445±0.310ab蟲草益腎方組100.419±0.041c1.418±0.029abc1.068±0.088abc福辛普利組100.614±0.072bc1.277±0.063abc0.722±0.051abcF值32.5212 393.3591 590.451P值<0.001<0.001<0.001

MMP-7:基質金屬蛋白酶7；a與空白組比較，P<0.05；b與假手術組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05

MMP：基質金屬蛋白酶

3 討 論

腎間質纖維化是多種CKD最終都要經歷的病理改變，腎間質纖維化時腎臟的固有結構被增生的纖維組織替代，腎功能逐漸喪失。近年來，腎間質纖維化在CKD進展中的重要性逐漸被認識，延緩腎間質纖維化進展逐漸成為臨床治療CKD的重要舉措[5-7]。大量研究表明中醫藥防治CKD具有多靶點、不易產生耐藥性、長期使用不良反應少、臨床療效肯定等優點，逐漸得到臨床腎臟病醫師的認可[8-13]。中醫學認為CKD病機是以“正虛邪實”為關鍵，正虛是以肺、脾、腎三臟不足為主，邪實是以體內“濁、痰、瘀、毒”壅盛為標?！疤摗薄皾帷薄疤怠薄梆觥薄岸尽蔽宕蟓h節，貫穿于CKD發生、發展的全過程。因此，治療CKD應標本兼顧，扶正祛邪。

宋立群教授基于中醫“氣化”學說，提出了“補肺健脾益腎，泄濁祛瘀解毒”的治療原則，并總結出經驗方蟲草益腎方，得到了較好的臨床效果[9-10,14-15]。蟲草益腎方由冬蟲夏草菌絲粉、黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草6味藥物組成。其中蟲草甘溫，重在補肺益腎。大黃泄濁祛瘀解毒，黃芪重在健脾化痰，貓須草利水解毒，水蛭破血逐瘀，草豆蔻長于燥濕健脾，芳化疏利，旨在恢復三焦氣化。方中蟲草、黃芪為主藥，意在補肺健脾益腎，大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草為輔藥，意在泄濁祛瘀解毒。藥雖六味，性味歸經，蟲草主入，黃芪主升，大黃主降，貓須草、水蛭、草豆蔻主出，充分體現了“氣化”學說的升降出入原則[8,16-18]。

Wnt/β-catenin信號通路是近年來在CKD領域研究較為廣泛的一個細胞信號通路。體內外研究均表明，Wnt/β-catenin信號通路下游調控著數個與腎間質纖維化密切相關的靶基因，如Snail1、纖溶酶原激活物抑制劑-1、MMP-7等[19]。Wnt/β-catenin信號通路的活化與腎間質纖維化的進展密切相關，靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效抑制成纖維細胞的增殖與活化[20]，上皮細胞的表型轉換[21]，抑制UUO大鼠腎間質纖維化的進展[22]。近年來實驗研究發現，經典途徑的Wnt/β-catenin信號通路較非經典途徑的Wnt/β-catenin信號通路在UUO導致的腎間質纖維化發病中發揮更重要的作用[23]。部分中藥單體抗纖維化的研究證明，某些中藥單體成分可以通過干預Wnt/β-catenin信號通路發揮抗纖維化的作用機制，表明Wnt/β-catenin信號通路同樣可能是中藥抗腎間質纖維化的重要治療靶點[5-7]。

本研究結果顯示，單側輸尿管梗阻后第28天，UUO大鼠24 h尿蛋白定量明顯升高，血肌酐、尿素氮水平顯著升高，高于正常大鼠與假手術組大鼠(P<0.05)。在給予大鼠蟲草益腎方或福辛普利干預后，大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮水平較模型組明顯降低(P<0.05)，有效保護了大鼠腎功能。此外，UUO大鼠腎組織中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均較正常大鼠顯著升高，而運用蟲草益腎方或福辛普利干預后，大鼠腎組織中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均較模型組有所降低(P<0.05)。說明Wnt/β-catenin信號通路與UUO大鼠梗阻腎組織纖維化進展密切相關，UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt4/Wnt5a以及MMP-7水平均明顯升高，且與大鼠梗阻腎組織正常結構被破壞，炎癥細胞浸潤，腎間質纖維化以及腎小球硬化的程度保持一致。各組間Wnt/β-catenin信號通路相關分子的表達水平與其腎間質纖維化程度保持一致，說明Wnt/β-catenin信號通路的活化與UUO大鼠腎間質纖維化密切相關，Wnt/β-catenin信號通路會進一步加重UUO大鼠腎間質纖維化的進展。

本研究進一步研究發現，給予大鼠蟲草益腎方或福辛普利干預均可有效抑制UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt/β-catenin信號通路活化以及相關信號分子的表達。同時蟲草益腎方與福辛普利均可有效抑制UUO大鼠梗阻腎組織的結構損傷與破壞，減輕腎組織中炎癥細胞的浸潤，延緩腎間質纖維化以及腎小球硬化的進展。蟲草益腎方對UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt/β-catenin信號通路以及腎間質纖維化的抑制作用明顯大于福辛普利，說明Wnt/β-catenin信號通路的活化可能是UUO大鼠腎間質纖維化發生發展的重要信號通路，且其可能是蟲草益腎方與福辛普利治療腎間質纖維化的重要機制之一，值得深入研究。

總之，腎間質纖維化是多種慢性腎臟損傷的共同病理改變，各種原因引起的腎損傷均可能通過多種機制導致腎間質纖維化。中藥復方具有多種有效成分，通過同時干預多個靶點而發揮療效的特殊作用機制已得到廣大學者的認可。蟲草益腎方作為典型的中藥復方，同樣具有這一特點。雖然蟲草益腎方在延緩腎間質纖維化的療效上已得到大量臨床研究和實驗研究的證實，但具體作用機制的研究尚屬于初始階段，仍需要進一步的研究與探討。