ImageJ軟件在醫學科研領域中的應用研究現況＊

黎 晨，尤培蒙，皮啟星，王晨曦，何俊霞，肖文媛，拜思瓊，趙 晉

（西北民族大學醫學院，甘肅 蘭州 730030）

圖像分析在許多生命科學領域，特別是醫學科研領域方面是非常重要的。一組好的數據是得到一個滿意的實驗結果的必要組成部分。目前，數據圖像的數量正呈指數級增長，且圖像的視覺檢測和人工測量是一項耗時的任務，缺乏靈敏度、準確性、客觀性和可重復性[1]。所以，為了避免人為的選擇偏倚和測量偏倚，提高數據準確性與實驗的客觀性，研究人員迫切需要某種軟件來提供自動或半自動的成像技術。

ImageJ是一款由Bethesda，MD于美國國立衛生研究院（NIH）研發的基于Java的公共免費圖像處理和分析程序[2]，可運行于Windows、Mac OS和Linux系統，其本身可以對圖像進行像素焦點計數和大小定義，并正確的計數重合焦點，還能測量每個單獨焦點的綜合光密度（IOD），且支持圖像棧功能，即在一個窗口里以多線程的形式層疊多個圖像，并行處理等等功能決定了ImageJ軟件可進行細胞焦點計數分析、面積百分比的比較與測定、3D圖像特征量化分析、細胞和生物體共定位、組織形態分析、血管相關密度分析等圖像量化分析功能。ImageJ作為一個開源軟件，擁有大量免費插件[4]，它可以被自由地檢查、修改和重新開發[5]，不但可提高圖像分辨率與清晰度，還可根據需要功能安裝相應的插件。用戶亦可利用Java平臺進行編程用來開發目前缺少的適用插件，來滿足當前需要的功能。由于該軟件具備的強大功能，所以ImageJ軟件廣泛應用于國外的醫學研究領域與其他研究領域中。

1 應用領域

1.1 細胞焦點計數與分析

為了評估冷凍消融前后的T細胞浸潤情況，Cerqueira MA等[6]使用ImageJ軟件進行CD4+/CD8+比值的定量分析，并可比較Diag+、Diag-、Cryo+和Cryo-之間的差異。除細胞外，Bera T等[7]用ImageJ與傳統技術如光密度、流式細胞技術和qPCR進行驗證，發現該軟件可根據不同微生物的進行定制，以估計不同的病原體。該方法還可以檢測～100細菌cfu/mL或通過增加成像和計算時間估計更低的濃度。

1.2 面積與面積百分比

使用ImageJ比較緊張和松弛狀態下的肛提肌擴張容積，測量提上瞼裂孔(LH)和泌尿生殖道裂孔(UGH)和矢狀面中部面積，結合t檢驗、效應大小和Pearson相關系數進行測量比較顯示該結果具有統計學意義[3]。Abou Eitta RS等[8]用ImageJ測量采用兩種方式治療痤瘡疤痕后顯示瘢痕面積百分比明顯下降，結果表明兩只治療方法均有效，但兩種治療方法療效差異并不顯著。

1.3 3D圖像特征量化分析

對3D圖像的測定與分析一直是醫學研究中的一大難題，一方面不能確保數據的準確性，另一方面數據的不完整性都是是需要克服的問題。Erguvan等[9]在ImageJ中研發了一個宏SurfCut用于提取表皮細胞輪廓信號，允許從3D共聚焦堆棧中提取細胞輪廓。其次，通過ImageJ軟件自帶的3D圖像分析功能，Ayuso-Montero R[10]通過對口腔3D表面掃描進行咬合接觸面（OCA）評估，與T掃描相比較，通過組內相關系數（ICC）評定，發現相較于3D掃描，T掃描測量OCA的方法更為可靠。“DiAna”：一個ImageJ附加程序[11]，可自動對對象進行協同定位和距離分析并提供對物體之間的協同定位的深入分析，檢索3D測量包括共同定位體積和接觸表面。

1.4 蛋白定位與共定位

蛋白定位分析大多來自于多通道、高分辨率、熒光顯微圖像且常為大量數據。ImageJ則提供了簡單、可定制和可重現的多通量化分析的方法[12]。Escorcia W等[13]將軟件應用于活細胞成像技術，并根據數據分析評估了蛋白質運動、定位、穩定性和計時以及核動力學和染色體分離，將其結果與普通顯微鏡方法進行比較。軟件里包含的“Coli-Inspector”功能支持自動和交互方法的組合，是可以完全控制圖像分析和數據收集的方法，并使用目視檢查工具快速消除偽影。能根據細胞分裂周期、細胞年齡對細胞進行分類，并分析每個蛋白的空間定位模式[14]。

1.5 組織形態分析

組織學研究的主要部分是使用高分辨率成像進行數據收集和分析，使用ImageJ是從高分辨率橫斷面圖像測量皮質骨區域的半自動方法[15]。Shukla S等[16]建立小鼠角膜損傷模型，通過ImageJ計算評分角膜混濁程度，評估了不同的給藥方式(局部，結膜下，腹腔內和靜脈注射)促進組織修復和恢復角膜透明性的效果。

1.6 血管相關密度分析

光學相干斷層血管造影（OCT-A）用于評估血管與微血管的變化情況，ImageJ可用于測量不同OCT-A掃描的糖尿病患者血管與灌注密度改變，根據結果比較哪種掃描方式更具代表性[17]以及評價濾過手術前后結膜血管生成的變化，進行濾過性手術的成功程度相關性分析[18]。

1.7 ImageJ與其他工具軟件結合比較

1.7.1 ImageJ與Photoshop

通過灰度直方圖分析，使用組內相關系數(ICCs)和測量的標準誤差(SEM)來評價和比較Photoshop和ImageJ用于老年人肌肉組織回聲的可靠性[19]。結果顯示兩款軟件的結果無明顯差異，但與Photoshop和ImageJ一起使用的ROI選擇方法更適用于老年人組織回聲的采集后圖像分析。McKenzie等[20]將ImageJ與Photoshop結合進行了母雞卵泡尿囊膜(HET-CAM)試驗，通過檢測對微小血管的損傷量化新型凝膠制劑的刺激性潛力，結果表明該藥物對眼組織無刺激性。在橫斷面研究里，Lim HW等[21]測量下斜肌過度活動的程度，用Photoshop對圖像進行處理，ImageJ進行分析結合相關系數的計算與回歸評估，得出結果1級、2級、3級和4級的下斜肌過度動作的平均角度分別為 10.5±9.1°、16.8±7.8°、24.3±8.8°和 40.0±12.2°(P<0.001)。

1.7.2 ImageJ與Slice-O-Matic

Irving BA等用此兩款軟件分析了腹部脂肪組織的橫截面積。Bland-Altman分析表明[22]ImageJ與Slice-O-Matic的結果具有可比性。測量間的變異系數分別為0.9%～4.8%和0.2%～2.6%，獲得的aVF橫截面積之間平均差異的95%置信區間為(-5.7，+10.8 cm)。提示該兩款軟件并無明顯差異，其結果都提供了對脂肪組織和骨骼肌橫截面積的可靠測量并具有統計學意義。

2 插件

2.1 軟件研究現況

在新興科學的需求下對ImageJ的發展提出了相應的挑戰。很多實驗結果的分析應用原生的ImageJ已經不足以滿足實驗的需求，這迫使研究人員們另辟新徑，不斷改進和完善ImageJ的生態系統和功能。于是，為了滿足各種不同實驗要求的各式插件也就相繼而生。不過并不是所有的插件都是可用于實驗結果的分析，下面結合了各大搜索引擎（中國知網、萬方、PubMed、GeenMedical、SCI（科學引文索引）數據庫）的檢索結果后，簡單羅列了幾個目前功能相對完善，結果分析較準確的ImageJ插件。

2.2 相關插件

2.2.1 Custom Macros

“Custom Macros”插件自動和系統化了神經組織圖像分析中的用戶交互功能，包括區域選擇和閾值、點/對象計數、面積測量、批量過濾處理和數據審查。在進行多個神經化學探針的神經組織成像實驗和覆蓋不同腦區的實驗時可用于分析和處理數百張顯微圖像組成的結果數據集[23]。

2.2.2 AxonTracer

脊髓組織切片中軸突的數量級靠人工計數難以量化分析，于是Patel A等[24]開發了一款名為“AxonTracer”的插件，旨在彌補ImageJ在量化計數軸突時的不足，用于自動分析受損神經系統中再生的軸突。該插件可根據免疫組織學染色識別移植細胞、移植物或其他陽性區域(ROI)，并對ROI內的再生軸突進行跟蹤量化。

2.2.3 Cell Concentration Calculator(CCC)與Transwell Counter

在用ImageJ計數細胞時，有時可因為圖像上的色差，雜質和板塊等異物以及背景顏色的影響而產生不同程度上結果的偏差[25]。“CCC”與“Transwell Counter”結合使用可在最小背景下獲取高質量縮微圖，用于快速計數和分析大樣本大小，內置分析工具幫助校準計數。前者用于圖像體積校正，后者用于圖像采集與平場。此插件僅適用于自動血細胞分析儀(或已知體積)和遷移/侵襲細胞計數[26]。然而由于細胞計數時的不可控因素太多，再好的插件也只能降低偏差的發生，不能做到完全準確的程度。所以在計數細胞時，圖像的飽和度、對比度、亮度、增益、平均銳度仍需要憑借經驗來滿足最佳計數條件。

2.2.4 SarcOptiM

SarcOptiM包括一個心肌細胞收縮的模擬器和視頻發生器用來采集參數。可以實時或離線工作，后者能克服旋轉運動或與位移相關的偽影[27]，如對ImageJ中捕獲或顯示的視頻幀進行傅里葉變換分析來計算肉瘤長度，從而允許實時或離線測量肉瘤長度[28]。此插件主要用來測量肌節長度，評估心肌細胞的收縮功能。

2.2.5 QuantIF

為了定量測定病毒感染的免疫熒光蛋白表達，Handala L等[29]開發了一個 ImageJ宏插件“QuantIF”，使用DAPI和Specific-染色法自動確定來自同一場的兩個圖像的細胞總數和標記細胞數，可自動分析數個圖像，每幅圖約需一秒。

2.2.6 NucleusJ

該插件專門用于在3D中表征核形態和染色質組織。從圖像堆棧開始，將Otsu分割方法與核球度優化相結合，確定核邊界。染色質結構域通過使用3D分水嶺算法分割細胞核并通過在結果區域上閾值對比度測量來分割。輸出時，NucleusJ量化了15個參數，包括核的形狀和大小以及核內物體及其在核內的位置[30]。

3 結語

ImageJ軟件雖然功能強大，應用范圍廣，但想要得到期望的結果必須是在正確使用該軟件及其插件作為前提。在確保軟件操作規范后，ImageJ軟件的量化數據既可作為終點指標直接對結果進行說明與判定，也可當作中間指標作為后續分析檢驗的數據來源，亦或是作為輔助數據，從側面襯托最終結果的可靠性與可信度。值得提出的是，使用ImageJ軟件分析都有一個共同點，就是其結果必須進行檢驗或回歸分析等，并判斷有無臨床意義，因為此軟件的應用僅為客觀的量化數據分析結果，最大限度上避免了人工分析或計數檢測的主觀性對實驗造成的偏差，也就是說，ImageJ軟件提供了一個對實驗進行的測定分析的平臺，其得出的數據可靠性還需做后續檢驗，進行比較，來確定測定數據的可用性程度。

ImageJ軟件仍有許多已知和未知的功能，或是經過驗證或是仍處于驗證階段，國內的研究人員對結果的測量可以傾向于對該軟件的驗證與開發，從而加快實驗進程、提高實驗科學性、為臨床科研提供參考。