基于非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR位點(diǎn)信息分析

林發(fā)壯 李錦燁 安慧珍 黃琦 姚鳳琴 鐘琳珊 陳昌銘 郭蕓瑋

摘?要：為深入開發(fā)非洲菊SSR分子標(biāo)記，進(jìn)而推動(dòng)非洲菊遺傳多樣性研究，以云南紅非洲菊的轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)，對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。結(jié)果表明：通過MISA軟件從60563條unigenes 檢測(cè)出14928個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于11932條unigenes中，出現(xiàn)頻率為24.65%，平均分布距離為3.43 kb。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)閱魏塑账帷⒍塑账岷腿塑账幔謩e占總SSR位點(diǎn)的63.44%、21.54%和14.06%。14928個(gè)SSR 位點(diǎn)由73種重復(fù)基序構(gòu)成，（A/T）、（AG/CT、AC/GT）、（AAT/ATT、AAG/CTT）分別是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，分別占總SSR重復(fù)類型的62.31%、18.13%和6.93%。利用 Primer 3.0對(duì)SSR序列設(shè)計(jì)引物9535對(duì)，成功率為63.87%。非洲菊轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)豐富，分布密度大，具有較高的多態(tài)性潛能，可作為開發(fā)SSR標(biāo)記的有效來源，為非洲菊遺傳多樣性研究，分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建以及功能基因挖掘等提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：非洲菊;轉(zhuǎn)錄組;SSR引物;位點(diǎn)信息

中圖分類號(hào)：S682.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）11-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.11.001

Abstract： In order to further develop the SSR molecular markers and promote the researches on the genetic diversity of Gerbera jamesonii L.， the SSR loci were mined on the basis of the transcriptome sequencing of Yunnan Red Gerbera jamesonii L..The results showed that 14928 SSR sites were detected from 60 563 unigenes by the MISA software， which were distributed among 11932 unigenes， with a frequency of 24.65% and an average distribution distance of 3.43 kb. The predominant repeat motifs were mononucleotide， dinucleotide， and trinucleotide， which accounted for 63.44%， 21.54%， and 14.06% of the total SSR loci， respectively. A total of 14928 SSR loci consisted of 73 kinds of repeat motifs. Among them， A/T， AG/CT， AC/GT， AAT/ATT， and AAG/CTT were the predominant repeat motifs of mononucleotide， dinucleotide， and trinucleotide， accounting for 62.31%， 18.13%， and 6.93% of the total SSR repeats， respectively. Primer 3.0 was used to design 9535 pairs of SSR sequencing primers， and the success rate was 63.87%. Therefore， Gerbera jamesonii L.. had abundant SSR loci with transcription sites， large distribution density， and excellent polymorphism potential. It could be used as an effective source for the development of SSR markers， and would provide scientific basis for the study of genetic diversity， molecular markerassisted breeding， genetic map construction， and functional gene mining， etc.

Key words： Gerbera jamesonii L.; Transcriptome; SSR primer; Information of loci

非洲菊Gerbera jamesonii L.為菊科大丁草屬植物，其花色、瓣型等都有豐富的類型。非洲菊用途非常廣泛，而且用量極大，世界五大鮮切花之一[1];不僅可以用于瓶插裝飾，還可以做宿根花卉，用于庭院叢植、花海等園林綠化均有極好的效果。栽培非洲菊品種多為二倍體，種間高度雜合，基因組大小預(yù)估在2.56～3.84 G[2]，至今尚未有非洲菊基因組測(cè)序相關(guān)報(bào)道，而且非洲菊ESTsSSR位點(diǎn)的相關(guān)研究幾乎空白。本研究基于前期工作中對(duì)非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得60563條unigenes 序列，使用SSR軟件MiscroSAtellite（MISA）鑒別所有轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)信息，分析其分布及組成特征，以期利用SSR分子標(biāo)記對(duì)非洲菊種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和分子輔助育種等研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉所2020年3月對(duì)云南紅非洲菊品種的植株進(jìn)行Illumina高通量深度測(cè)序。測(cè)序取云南紅非洲菊種苗地上部材料，材料處理如下：（1）種苗;（2）與印度梨形孢真菌共生的種苗;（3）45℃熱處理6 h種苗;（4）45℃熱處理6 h與印度梨形孢真菌共生的種苗。委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行RNAseq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并通過de novo方法組裝得到unigenes，作為背景數(shù)據(jù)。

1.2?數(shù)據(jù)分析及SSR引物設(shè)計(jì)

采用MISA程序查找SSR位點(diǎn)（https：//webblast.ipkgatersleben.de/misa/），參數(shù)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為：單核苷酸Mononucleotide、二核苷酸Dinucleotide、三核苷酸Trinucleotide、四核苷酸Tetranucleotide、五核苷酸Pentanucleotide和六核苷酸Hexanucleotide最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5次。采用Primer 3.0（2.3.5版，默認(rèn)參數(shù)）設(shè)計(jì)引物，標(biāo)準(zhǔn)為：引物長度18～24 bp，GC含量40%～60%，理論退火溫度（Tm）55.0～65.0℃，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度在150～300 bp。

2?結(jié)果與分析

2.1?非洲菊轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

通過對(duì)非洲菊轉(zhuǎn)錄組60563條unigenes序列（總長為51138993 bp）進(jìn)行搜索，在其中11932條unigenes 序列中檢測(cè)出14928個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR發(fā)生頻率為19.70%，出現(xiàn)頻率為 24.65%。其中9521條unigenes 序列僅包含1個(gè)SSR位點(diǎn)，2380條含有兩個(gè)及兩個(gè)以上SSR位點(diǎn)，另外有1197條unigenes序列含有復(fù)合型SSR位點(diǎn)，平均3.43 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)（表1）。由于SSR長度的變異來源于重復(fù)單元次數(shù)的不同，非洲菊的轉(zhuǎn)錄組SSR各種重復(fù)類型均有，重復(fù)次數(shù)分布在5～46次，而且出現(xiàn)頻率存在較大差異（表2），其中10次重復(fù)的SSR最多，占26.02%;其次是6次重復(fù)的SSR，占9.15%;5次重復(fù)的SSR占8.97%。其中5～11次重復(fù)的SSR有10195個(gè)，占總數(shù)的68.29%;12～22次重復(fù)的SSR有4412個(gè)，占比為29.56%;23次以上重復(fù)的SSR有321個(gè)，只占2.15%。其中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型SSR出現(xiàn)頻率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型 SSR數(shù)量少;單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元的數(shù)量分別有9470、3216、2099、77、21和45個(gè)，分別占總SSR數(shù)的63.44%，21.54%、14.06%、0.52%、0.14%和0.30%。

2.2?轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

由表3可知，從非洲菊轉(zhuǎn)錄組SSR基序類型看，14928個(gè)位點(diǎn)共包含73種重復(fù)基序類型，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)各有2、4、10、14、11和32種;從SSR重復(fù)頻率分析，其中單核苷酸重復(fù)單元有2種類型，其中A/T類型的重復(fù)基序出現(xiàn)頻率最多有9301個(gè)，占該類型的98.22%，C/G基序類型僅有169個(gè)，占1.77%（表3）。二核苷酸重復(fù)單元有4種類型，其中AG/CT和AC/GT基序出現(xiàn)頻率最高，分別為44.47%和39.71%，其次為AT/AT，最少為CG/CG基序類型，只有40個(gè)。三核苷酸重復(fù)單元有10種類型，其中AAT/ATT和AAG/CTT基序類型出現(xiàn)頻率最高，分別占24.92%和24.39%。四核苷酸重復(fù)類型有14種，AAAT/ATTT和ACAT/ATGT基序類型占主導(dǎo)地位，分別占32.47%和23.38%。五核苷酸重復(fù)類型有11種，其中AAACC/GGTTT基序類型頻率最高，占28.57%，其次是AAAAC/GTTTT和AAAAG/CTTTT基序類型，分別占14.29%和14.29%。六核苷酸重復(fù)單元類型最多有32種，其中AAAAAC/GTTTTT基序類型個(gè)數(shù)最多，有4個(gè)占8.89%，其次AATTCC/AATTGG基序型有3個(gè)，其他類型不超過2個(gè)。

2.3?非洲菊轉(zhuǎn)錄組中SSR基序長度及引物設(shè)計(jì)

非洲菊轉(zhuǎn)錄組中SSR基序長度分布如圖1。從圖1可知，大部分基序長度集中在12～20 bp，占47.57%（6532條）;其次是小于12 bp，占35.02%（4809條）;再次基序長度是21～30 bp，占8.15%（1119條）;30 bp以上的基序很少，共占9.26%（1 271條），這類SSR具有較高的多態(tài)性。

利用Primer 3.0對(duì)14928個(gè)含有SSR位點(diǎn)的unigenes 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并針對(duì)預(yù)測(cè)到的每一個(gè)SSR位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了3組引物，取其中一組作為后續(xù)分析，成功設(shè)計(jì)出9535對(duì)SSR序列引物，成功率為63.87%。為進(jìn)一步提高及驗(yàn)證非洲菊SSR引物的可用性和有效性，去除包含單核苷酸SSR位點(diǎn)序列，篩選得到SSR長度12 bp及以上包含復(fù)合及二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元的SSR位點(diǎn)序列，成功設(shè)計(jì)出5228對(duì)引物，從中篩選出SSR長度20 bp以上序列設(shè)計(jì)出2220對(duì)引物。

3?討論與結(jié)論

本研究從云南紅非洲菊品種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得60563條unigenes 序列，從中搜索發(fā)現(xiàn)其中11932條unigene序列中含有14928個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中 2380條含有兩個(gè)及兩個(gè)以上SSR位點(diǎn)。SSR發(fā)生頻率為19.70%，SSR的出現(xiàn)頻率為24.65%，平均3.43 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)，其出現(xiàn)頻率與朱頂紅（25.13%）[3]、錦繡杜鵑（24.46%）[4]、牡丹（25.52%）[5]等觀賞植物相似，高于濕地松（4.80%）[6]、桂花（13.62%）[7]、三色堇（14.20%）[8]、紫斑牡丹（14.58%）[9]、山茶（19.52%）[10]、蘭屬植物（20.84%）[11]、紫薇（21.53%）[12]等植物;低于三角梅（44.91%）[13]、菊花（45.71%）[14]、桐花樹（68.55%）[15]等植物，這表明非洲菊轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率處于中等水平，這種頻率差異可能與物種基因組大小差異、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源特定時(shí)期和特定器官、SSR開發(fā)方式及篩選標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)[16-17]。

非洲菊轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元較為豐富，6種核苷酸重復(fù)基元均有出現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元為單核苷酸重復(fù)類型，占SSR總數(shù)的63.44%，其次為二核苷酸重復(fù)類型（21.54%）和三核苷酸重復(fù)類型（14.06%），三者共占SSR總數(shù)的99.04%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量最少，分別占0.52%、0.14%和0.30%;這與柿[18]、黃麻[19]、三角梅[13]和黑枸杞[20]等植物單核苷酸占主導(dǎo)地位的研究結(jié)果一致，而已有研究報(bào)道表明大多數(shù)植物種SSR的主要類型是二、三核苷酸重復(fù)類型[21-24]，也有少數(shù)植物是六核苷酸重復(fù)類型[22，25-26]。非洲菊這種以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸SSR基序?yàn)橹黧w，而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR基序占少數(shù)的分布可能是因?yàn)樽陨砦锓N特異性差異及自然選擇的結(jié)果。另外，作為雙子葉植物的非洲菊SSR中單核苷酸出現(xiàn)頻率最多的基序是A/T，二核苷酸出現(xiàn)頻率最多的基序是AG/CT和AC/GT，三核苷酸出現(xiàn)頻率最多的基序是AAT/ATT和AAG/CTT，這與其他雙子葉植物上的研究結(jié)果基本一致[13，19，22]。

研究發(fā)現(xiàn)SSRs重復(fù)單元頻率的不同將導(dǎo)致SSR位點(diǎn)的長度變化，因此研究SSRs基序長度變化是分析物種多態(tài)性高低的重要因素[27-29]。當(dāng)SSRs基序長度集中在12～20 bp多態(tài)性中等，基序長度大于20 bp的SSR多態(tài)性較高[28-31]。分析非洲菊轉(zhuǎn)錄組SSRs重復(fù)12次以上的比例為31.71%，這表明非洲菊轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)數(shù)較高，具有良好的多態(tài)性潛能;本研究發(fā)現(xiàn)非洲菊轉(zhuǎn)錄組中有47.57%的SSRs集中在12～20 bp，有17.41%的SSRs長度大于20 bp，這表明非洲菊的SSRs具有良好多態(tài)性。針對(duì)14928個(gè)含有SSR位點(diǎn)的unigenes進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)9535對(duì)引物，成功率為63.87%，得到潛在中高多態(tài)性引物7448對(duì)。本研究結(jié)果可為非洲菊遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助育種等研究提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）