基于非洲菊轉錄組測序的SSR位點信息分析

林發壯 李錦燁 安慧珍 黃琦 姚鳳琴 鐘琳珊 陳昌銘 郭蕓瑋

摘?要：為深入開發非洲菊SSR分子標記，進而推動非洲菊遺傳多樣性研究，以云南紅非洲菊的轉錄組序列為基礎，對SSR位點進行挖掘。結果表明：通過MISA軟件從60563條unigenes 檢測出14928個SSR位點，分布于11932條unigenes中，出現頻率為24.65%，平均分布距離為3.43 kb。優勢重復基序為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR位點的63.44%、21.54%和14.06%。14928個SSR 位點由73種重復基序構成，（A/T）、（AG/CT、AC/GT）、（AAT/ATT、AAG/CTT）分別是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸優勢重復基元，分別占總SSR重復類型的62.31%、18.13%和6.93%。利用 Primer 3.0對SSR序列設計引物9535對，成功率為63.87%。非洲菊轉錄組SSR位點豐富，分布密度大，具有較高的多態性潛能，可作為開發SSR標記的有效來源，為非洲菊遺傳多樣性研究，分子標記輔助育種、遺傳圖譜構建以及功能基因挖掘等提供科學依據。

關鍵詞：非洲菊;轉錄組;SSR引物;位點信息

中圖分類號：S682.1?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）11-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.11.001

Abstract： In order to further develop the SSR molecular markers and promote the researches on the genetic diversity of Gerbera jamesonii L.， the SSR loci were mined on the basis of the transcriptome sequencing of Yunnan Red Gerbera jamesonii L..The results showed that 14928 SSR sites were detected from 60 563 unigenes by the MISA software， which were distributed among 11932 unigenes， with a frequency of 24.65% and an average distribution distance of 3.43 kb. The predominant repeat motifs were mononucleotide， dinucleotide， and trinucleotide， which accounted for 63.44%， 21.54%， and 14.06% of the total SSR loci， respectively. A total of 14928 SSR loci consisted of 73 kinds of repeat motifs. Among them， A/T， AG/CT， AC/GT， AAT/ATT， and AAG/CTT were the predominant repeat motifs of mononucleotide， dinucleotide， and trinucleotide， accounting for 62.31%， 18.13%， and 6.93% of the total SSR repeats， respectively. Primer 3.0 was used to design 9535 pairs of SSR sequencing primers， and the success rate was 63.87%. Therefore， Gerbera jamesonii L.. had abundant SSR loci with transcription sites， large distribution density， and excellent polymorphism potential. It could be used as an effective source for the development of SSR markers， and would provide scientific basis for the study of genetic diversity， molecular markerassisted breeding， genetic map construction， and functional gene mining， etc.

Key words： Gerbera jamesonii L.; Transcriptome; SSR primer; Information of loci

非洲菊Gerbera jamesonii L.為菊科大丁草屬植物，其花色、瓣型等都有豐富的類型。非洲菊用途非常廣泛，而且用量極大，世界五大鮮切花之一[1];不僅可以用于瓶插裝飾，還可以做宿根花卉，用于庭院叢植、花海等園林綠化均有極好的效果。栽培非洲菊品種多為二倍體，種間高度雜合，基因組大小預估在2.56～3.84 G[2]，至今尚未有非洲菊基因組測序相關報道，而且非洲菊ESTsSSR位點的相關研究幾乎空白。本研究基于前期工作中對非洲菊轉錄組測序獲得60563條unigenes 序列，使用SSR軟件MiscroSAtellite（MISA）鑒別所有轉錄組的SSR位點信息，分析其分布及組成特征，以期利用SSR分子標記對非洲菊種質資源進行遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建和分子輔助育種等研究奠定一定的基礎。

1?材料與方法

1.1?轉錄組數據來源

非洲菊轉錄組數據來源于三明市農業科學院花卉所2020年3月對云南紅非洲菊品種的植株進行Illumina高通量深度測序。測序取云南紅非洲菊種苗地上部材料，材料處理如下：（1）種苗;（2）與印度梨形孢真菌共生的種苗;（3）45℃熱處理6 h種苗;（4）45℃熱處理6 h與印度梨形孢真菌共生的種苗。委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行RNAseq轉錄組測序，并通過de novo方法組裝得到unigenes，作為背景數據。

1.2?數據分析及SSR引物設計

采用MISA程序查找SSR位點（https：//webblast.ipkgatersleben.de/misa/），參數設置標準為：單核苷酸Mononucleotide、二核苷酸Dinucleotide、三核苷酸Trinucleotide、四核苷酸Tetranucleotide、五核苷酸Pentanucleotide和六核苷酸Hexanucleotide最少重復次數分別為10、6、5、5、5和5次。采用Primer 3.0（2.3.5版，默認參數）設計引物，標準為：引物長度18～24 bp，GC含量40%～60%，理論退火溫度（Tm）55.0～65.0℃，預計產物長度在150～300 bp。

2?結果與分析

2.1?非洲菊轉錄組中SSR位點的數量與分布

通過對非洲菊轉錄組60563條unigenes序列（總長為51138993 bp）進行搜索，在其中11932條unigenes 序列中檢測出14928個SSR位點，SSR發生頻率為19.70%，出現頻率為 24.65%。其中9521條unigenes 序列僅包含1個SSR位點，2380條含有兩個及兩個以上SSR位點，另外有1197條unigenes序列含有復合型SSR位點，平均3.43 kb出現1個SSR位點（表1）。由于SSR長度的變異來源于重復單元次數的不同，非洲菊的轉錄組SSR各種重復類型均有，重復次數分布在5～46次，而且出現頻率存在較大差異（表2），其中10次重復的SSR最多，占26.02%;其次是6次重復的SSR，占9.15%;5次重復的SSR占8.97%。其中5～11次重復的SSR有10195個，占總數的68.29%;12～22次重復的SSR有4412個，占比為29.56%;23次以上重復的SSR有321個，只占2.15%。其中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復類型SSR出現頻率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型 SSR數量少;單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元的數量分別有9470、3216、2099、77、21和45個，分別占總SSR數的63.44%，21.54%、14.06%、0.52%、0.14%和0.30%。

2.2?轉錄組SSR基序重復類型和頻率特征

由表3可知，從非洲菊轉錄組SSR基序類型看，14928個位點共包含73種重復基序類型，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復各有2、4、10、14、11和32種;從SSR重復頻率分析，其中單核苷酸重復單元有2種類型，其中A/T類型的重復基序出現頻率最多有9301個，占該類型的98.22%，C/G基序類型僅有169個，占1.77%（表3）。二核苷酸重復單元有4種類型，其中AG/CT和AC/GT基序出現頻率最高，分別為44.47%和39.71%，其次為AT/AT，最少為CG/CG基序類型，只有40個。三核苷酸重復單元有10種類型，其中AAT/ATT和AAG/CTT基序類型出現頻率最高，分別占24.92%和24.39%。四核苷酸重復類型有14種，AAAT/ATTT和ACAT/ATGT基序類型占主導地位，分別占32.47%和23.38%。五核苷酸重復類型有11種，其中AAACC/GGTTT基序類型頻率最高，占28.57%，其次是AAAAC/GTTTT和AAAAG/CTTTT基序類型，分別占14.29%和14.29%。六核苷酸重復單元類型最多有32種，其中AAAAAC/GTTTTT基序類型個數最多，有4個占8.89%，其次AATTCC/AATTGG基序型有3個，其他類型不超過2個。

2.3?非洲菊轉錄組中SSR基序長度及引物設計

非洲菊轉錄組中SSR基序長度分布如圖1。從圖1可知，大部分基序長度集中在12～20 bp，占47.57%（6532條）;其次是小于12 bp，占35.02%（4809條）;再次基序長度是21～30 bp，占8.15%（1119條）;30 bp以上的基序很少，共占9.26%（1 271條），這類SSR具有較高的多態性。

利用Primer 3.0對14928個含有SSR位點的unigenes 進行引物設計，并針對預測到的每一個SSR位點分別設計了3組引物，取其中一組作為后續分析，成功設計出9535對SSR序列引物，成功率為63.87%。為進一步提高及驗證非洲菊SSR引物的可用性和有效性，去除包含單核苷酸SSR位點序列，篩選得到SSR長度12 bp及以上包含復合及二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元的SSR位點序列，成功設計出5228對引物，從中篩選出SSR長度20 bp以上序列設計出2220對引物。

3?討論與結論

本研究從云南紅非洲菊品種轉錄組測序獲得60563條unigenes 序列，從中搜索發現其中11932條unigene序列中含有14928個SSR 位點，其中 2380條含有兩個及兩個以上SSR位點。SSR發生頻率為19.70%，SSR的出現頻率為24.65%，平均3.43 kb出現1個SSR位點，其出現頻率與朱頂紅（25.13%）[3]、錦繡杜鵑（24.46%）[4]、牡丹（25.52%）[5]等觀賞植物相似，高于濕地松（4.80%）[6]、桂花（13.62%）[7]、三色堇（14.20%）[8]、紫斑牡丹（14.58%）[9]、山茶（19.52%）[10]、蘭屬植物（20.84%）[11]、紫薇（21.53%）[12]等植物;低于三角梅（44.91%）[13]、菊花（45.71%）[14]、桐花樹（68.55%）[15]等植物，這表明非洲菊轉錄組SSR出現頻率處于中等水平，這種頻率差異可能與物種基因組大小差異、轉錄組數據來源特定時期和特定器官、SSR開發方式及篩選標準有關[16-17]。

非洲菊轉錄組中SSR重復基元較為豐富，6種核苷酸重復基元均有出現，優勢重復基元為單核苷酸重復類型，占SSR總數的63.44%，其次為二核苷酸重復類型（21.54%）和三核苷酸重復類型（14.06%），三者共占SSR總數的99.04%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型數量最少，分別占0.52%、0.14%和0.30%;這與柿[18]、黃麻[19]、三角梅[13]和黑枸杞[20]等植物單核苷酸占主導地位的研究結果一致，而已有研究報道表明大多數植物種SSR的主要類型是二、三核苷酸重復類型[21-24]，也有少數植物是六核苷酸重復類型[22，25-26]。非洲菊這種以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸SSR基序為主體，而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR基序占少數的分布可能是因為自身物種特異性差異及自然選擇的結果。另外，作為雙子葉植物的非洲菊SSR中單核苷酸出現頻率最多的基序是A/T，二核苷酸出現頻率最多的基序是AG/CT和AC/GT，三核苷酸出現頻率最多的基序是AAT/ATT和AAG/CTT，這與其他雙子葉植物上的研究結果基本一致[13，19，22]。

研究發現SSRs重復單元頻率的不同將導致SSR位點的長度變化，因此研究SSRs基序長度變化是分析物種多態性高低的重要因素[27-29]。當SSRs基序長度集中在12～20 bp多態性中等，基序長度大于20 bp的SSR多態性較高[28-31]。分析非洲菊轉錄組SSRs重復12次以上的比例為31.71%，這表明非洲菊轉錄組SSR重復數較高，具有良好的多態性潛能;本研究發現非洲菊轉錄組中有47.57%的SSRs集中在12～20 bp，有17.41%的SSRs長度大于20 bp，這表明非洲菊的SSRs具有良好多態性。針對14928個含有SSR位點的unigenes進行引物設計，成功設計9535對引物，成功率為63.87%，得到潛在中高多態性引物7448對。本研究結果可為非洲菊遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種等研究提供技術支持。

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（責任編輯：柯文輝）