新型固體靶核素89Zr的制備、標記和臨床前應用研究進展

王 風，朱 華，李立強，郭曉軼，劉特立，楊 志

(北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫學科，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

以功能顯像為基礎的正電子計算機發射斷層掃描(PET/CT)，在提供病變解剖信息的同時還能提供病變的代謝和功能特征，可以動態監測癌癥患者的靶向治療療效，并對治療效果提供療效評價，廣泛應用于癌癥的良惡性診斷、分期與再分期、療效及預后評價等[1-4]。將正電子核素與抗體靶向治療藥物相連接并進行PET顯像即為腫瘤抗體PET免疫顯像(immuno-PET)。PET免疫顯像能夠實時、在體的監測腫瘤免疫治療藥物分子的體內分布、抗原-抗體結合和抗原特異性T細胞的生物學行為，是篩選適合抗體靶向治療的重要方法[5-6]。正電子核素鋯-89(89Zr)由于其較長的半衰期，能夠匹配抗體在體內代謝過程，使其成為PET免疫顯像的理想核素，同時89Zr還可以用于制備納米管、納米粒子和微球等，已經廣泛應用于臨床前研究[7-8]。雖然89Zr是良好的PET免疫顯像核素，但是國內尚未有廠家和機構能夠穩定生產并提供89Zr，國內急需開展89Zr的制備、純化、標記顯像等基礎研究和初步實驗，以期能夠穩定生產高質量的89Zr，并初步應用于臨床研究。本文對目前國內外固體靶制備89Zr核素、標記以及臨床應用進行簡要概述。

1 89Zr的性質

89Zr為正電子核素，通過電子俘獲和正電子衰變生成穩定核素89Y(IEC=76.6%，Iβ+=22.3%，Emax(β+)=897 keV，Eγ=908.9 keV，Iγ=100%)，物理半衰期T1/2=78.41 h，可以匹配某些具有相似生物半衰期抗體在體內的代謝過程，從而進行抗體標記PET免疫顯像。而常用的正電子核素18F、11C、68Ga半衰期只有109.7、20、67.7 min，都是短壽命核素，核素在進入實體腫瘤之前就已經衰變完全，無法反映抗體在體內的代謝過程。89Zr還具有較低的正電子能量，正電子自由行程距離短，能夠提供較高的PET顯像空間分辨率[9-10]。89Zr以及相關正電子核素的性質列于表1。

表1 主要正電子核素性質

2 固體靶核素89Zr的制備

目前89Zr的生產主要通過回旋加速器產生質子或氘核轟擊89Y獲得，主要的兩個核反應為89Y(p,n)89Zr或89Y(d,2n)89Zr，89Y(p,n)89Zr核反應需要的質子能量較低而被廣泛使用，核反應最大截面約14 MeV。

89Zr的生產需要采用合理的靶裝載方式，合適的質子能量、束流大小和轟擊時間，以及選擇高效的分離方法等。由于不同回旋加速器的構造、設計和束流引出方式不同，需要根據回旋加速器的構造設計匹配的靶裝載方式；其次束流大小和轟擊時間不僅影響89Zr的產量，還關系靶室的散熱，要根據回旋加速器的散熱承載能力優化回旋加速器轟擊參數；選擇快速高效的提純方法，以獲得高純度的產品，同樣是制備放射性藥物的關鍵。89Zr的制備流程主要包括：①靶的裝載；②回旋加速器的轟擊；③核素的提純。

2.1 靶的裝載方式

靶材料89Y常溫下為固體，通常將靶材料以薄膜、薄片、濺射鍍層或者電鍍的方式裝載到銅托或者鋁托上，不同的裝載方式具有不同的優缺點。薄膜/薄片可以直接購買，裝載較為方便，但是產量略低，需要及時散熱；濺射鍍層的方式可以進行高束流長時間轟擊，但是制備方法略微復雜；使用電鍍的方法將靶材料沉淀到靶托上進行轟擊為一種創新方法，但是電鍍需要在無水溶液下進行，沉淀物的粘合度和均勻性值得研究。薄膜/薄片由于成本低廉，裝載方便，是目前最常使用的裝載方式。

2.2 回旋加速器照射參數

89Y(p,n)89Zr的核反應能量范圍5～15 MeV，合適的質子能量才能獲得最佳的核反應產額。質子束流從加速器引出時經過管道、碳膜、真空膜和靶材料等物質后會有能量損失，需要進行計算和實驗選擇合適的轟擊能量。同時轟擊時間越長、束流越大產量也會越高，但是會帶來加速器承載以及散射等問題，所以選擇合適的轟擊時間，束流能量和束流大小是89Zr生產的關鍵，不少研究機構通過蒙特卡羅方法進行模擬計算優化回旋加速器轟擊參數，并進行實驗驗證。

2.3 核素提取和純化

89Y只有一種穩定的同位素形式，但是89Y(p,n)89mZr,89Y(p,2n)88Zr,89Y(p,pn)88Y等副反應會引入雜質，同時制靶過程中使用的銅托或者鋁托會帶入微量的銅、鐵、鎳等元素，會對競爭性標記產生影響，必須清除，只有高純的89Zr才能進行有效的藥物標記。離子交換樹脂法簡單方便，已成為目前最常使用的分離提純方法。將89Zr/89Y混合溶液經過活化的異羥肟酸樹脂，并使用草酸溶液淋洗可得到高純度的89Zr溶液。

相關文獻報道的89Zr的制備方法和產量比較[11-18]列于表2。由表2可以看出，不同的制備工藝、轟擊參數和純化方法等直接決定89Zr的核素產量。

表2 89Zr的制備方法比較

3 89Zr標記抗體

3.1 標記配體

為了防止標記的核素從產物中脫落，降低脫落的Zr4+沉積到骨骼中產生輻射損傷，提高標記產物的穩定性，89Zr標記需要使用合適的配體標記[19-20]。目前主要的配體有DTPA、EDTA、DFO等，以DFO標記的抗體最穩定，為89Zr標記的常規配合物，使用DTPA等螯合劑其標記成功率小于0.1%。以DFO為配體的89Zr通用標記步驟如下：①使用Na2CO3或HEPES緩沖液調節89Zr的草酸溶液至最佳pH，pH標定范圍一般為6.8～7.2；②加入DFO共軛抗體在室溫下反應30～60 min；③純化后通過高效液相色譜等方法測量放射性標記產物的純度，進行穩定性分析。

3.2 共軛連接

DFO可以通過幾種不同的共軛連接方式與抗體連接，不同的共軛連接方式不僅影響標記率的高低，也會影響標記產物的穩定性質，進而反映抗體在體內的分布性質，所以不同的抗體需要選擇不同的共軛連接方法，才能使得標記分子探針安全可靠。一種方法是將DFO通過S-乙酰巰基乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate,SATA)修飾，產生受保護的巰基，并在抗體中引入馬來酰亞胺基團，在一定pH下形成連接有DFO的標記抗體[21]。而Verel等[22]開發的TFP-N-琥珀酸DFO(N-suc-DFO)方法，通過四氟苯酚(2,3,5,6-tetrafluorophenol, TFP)修飾DFO后進行抗體標記，勿需抗體修飾且標記穩定。2010年Perk等[23]發明了經過改造的含異硫氰酸芐基(p-isothiocyanatobenzyl-bearing)DFO(DFO-BZ-NCS)標記方法，該方法簡單方便，而且螯合劑容易獲得，使其成為臨床最常使用的標記方法。

不同的共軛連接方法各有優缺點，N-suc-DFO方法標記產物穩定但標記步驟相對繁瑣，DFO-BZ-NCS方法標記更為方便但其水溶性較差。所以需要更多的專業研究選擇合適的共軛連接方法，標記方便且安全可靠的標記產物。

4 89Zr的臨床前應用

4.1 89Zr標記抗體PET免疫顯像

目前，美國食品藥品監督管理局(FDA)已經批準上市了多種免疫治療藥物，如抗體類治療藥物：曲妥珠單抗Ado-trastuzumab emtansine(Kadcyla)，本妥昔單抗Brentuximab vedotin(Adcetris)和替伊莫單抗Ibritumomab tiuxetan(Zevalin)等；以及免疫位點抑制劑，Ipilimumab(Yervoy)針對CTLA-4，Nivolumab(Opdivo)和pembrolizumab(Keytruda)針對PD1等[24]。新的治療靶點和新的聯合用藥方案是目前研究的熱點，許多研究機構已經開展了多項89Zr標記單抗的臨床前應用研究，用以分析抗體藥物在體內的代謝過程，評估腫瘤治療療效。有些研究已經進行了臨床轉化實驗，使用89Zr標記抗體進行PET免疫顯像已經顯現了其在免疫治療中的巨大潛力[25-26]。用于臨床(或臨床前)研究的89Zr免疫顯像抗體列于表3。

表3 用于臨床(或臨床前)研究的89Zr免疫顯像抗體

應用固體靶核素89Zr的PET免疫顯像臨床前及臨床中的研究表明，89Zr免疫顯像能夠充分反映抗體在腫瘤患者體內的分布和代謝情況，可通過PET顯像直觀地呈現抗體免疫治療的靶點是否作用于腫瘤特定部位，并觀測抗體免疫治療的治療效果，89Zr標記抗體PET免疫顯像對免疫治療的主要作用和優勢如下：1)89Zr具有較長的半衰期，與腫瘤部位特異性結合，能較長時間(一周以上)進行多次PET顯像，而常規的18F-FDG無法勝任；2)89Zr相較于124I、64Cu發射的正電子能量較低，對組織損傷較小，更加安全，并且PET圖像分辨率更好，能夠在低注射量下更清晰的顯示病灶；3) 為在體無創檢測方法，無需進行組織穿刺等有創操作；4) 能反映受檢者全身整體的藥物代謝分布情況，能夠提示遠端轉移的微小病灶或者淋巴結轉移；5) 分子影像能夠提示病灶成分的腫瘤異質性特征，通過影像學特征分析能進一步揭示腫瘤的內部微小信息；6) 影像檢查可以方便地對免疫治療后的患者進行療效評價，指導治療方案的制定和優化。

4.2 89Zr非抗體標記應用

89Zr除了用于抗體標記外，還被用于標記制備納米粒子、納米管和微球等[27-31]。譬如90Y微球可以進行許多腫瘤的內照射治療，使用89Zr標記的微球預先對腫瘤部位進行PET在體顯像，精確勾畫腫瘤靶區范圍，進行治療劑量計劃計算，優化治療流程，也可以進行療效評估。相較于其他核素標記，89Zr(T1/2=78.4 h)和89Y(T1/2=64.1 h)具有近似的半衰期，進行PET顯像效果更顯著。

89Zr標記的白蛋白納米膠體(89Zr-DFO-albumin)可以有效進行前哨淋巴結檢測，甚至可以在原發腫瘤周圍快速準確找到轉移的前哨淋巴結，其臨床檢測效果要比99mTc標記的白蛋白納米膠體可靠。89Zr標記的短鏈葡聚糖納米粒子(DNPs)可以進行巨噬細胞和炎癥顯像，其較長的半衰期可以在藥物注射24 h內有效地監測腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)狀態，指導腫瘤的臨床診斷和治療。89Zr還可以用于單壁碳納米管(SWCNT)的標記，標記物具有較大的表面積和低免疫原性，相關研究機構報道了89Zr碳納米管衍生物與腫瘤新生血管靶向抗體E4G10的標記，并進行了荷瘤小鼠體內PET顯像和評價，能夠特異性的快速顯示腫瘤位置。89Zr還可用于脂質體的標記，聯合89Zr標記的生長抑素受體奧曲肽脂質體和釓離子還可以進行PET/MRI多模態影像檢查。

此外，89Zr還可以用于部分多肽和抗體片段的標記，但是由于多肽等小分子在體內的清除率較快，多數使用短半衰期的核素(18F、68Ga等)進行標記，而只有觀察一些大的多肽聚合物在體內的藥代動力學過程才使用89Zr標記。

5 小結

89Zr的PET免疫顯像在腫瘤抗體免疫診斷治療中顯現了重要作用，較長的半衰期能夠與抗體在體內的代謝過程很好的契合，標記抗體能夠特異性、靶向性的指示腫瘤的代謝特征，有效進行腫瘤適應癥篩選和療效評估。

雖然國外許多機構已經開展89Zr的生產及應用，但是目前國內還沒有機構或者廠家可以穩定提供高純度89Zr核素，快速、方便的獲得高純度89Zr和標記產物是開展臨床應用的重要前提。