超聲波提取沙棘葉總黃酮的工藝優化試驗研究

劉英翠，張春媛，梁愛軍，史 鵬，馬 倩

(山西省林業和草原科學研究院， 山西 太原 030012)

我國是沙棘分布面積最大、種類最多的國家。沙棘已被列入藥食同源植物，富含多種營養成分和黃酮類等生物活性物質。現代醫學研究證實，沙棘黃酮具有抗心肌缺血、降低血清膽固醇、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理功效。據報道沙棘葉中黃酮含量最高，而對沙棘葉利用的研究較少，為了充分利用沙棘資源，對沙棘葉中總黃酮的提取及深加工利用進行研究具有重要意義。

目前，總黃酮的提取方法主要有索氏提取法、有機溶劑回流法、微波法等，這些方法存在溶劑使用量大，操作繁瑣、提取率低等缺點。利用超聲波產生的強烈振動、攪拌作用、空化效應等可加速有效成分的溶出、擴散，從而縮短提取時間，增加提取率，節約溶劑，避免高溫加熱萃取對黃酮成分的影響，最大程度保持沙棘黃酮的生物活性。筆者在傳統高溫加熱超聲提取方法的基礎上，通過正交優化試驗得出低溫加熱或常溫超聲條件下提取沙棘葉總黃酮的最佳工藝條件，保證了沙棘葉總黃酮的生物活性。該方法具有操作簡單、節約能耗、效率高等優點，可為提取沙棘葉黃酮類化合物的工業化生產提供依據。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

試驗所用沙棘葉采于山西省右玉縣。試驗試劑包括蘆丁標準品(≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)、蒸餾水、乙醇(95%)，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平(BSA223S-CW)、紫外可見分光光度計(UV-3100PC上海美譜達)、超聲波清洗機(SB-25-12DTDN)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅)、粉碎機、抽濾泵。

2 試驗方法

2.1 原料預處理

挑選沙棘葉，去刺，整理后于60 ℃條件下恒溫烘干，用食品研磨機研磨，過60目篩，得到干燥的沙棘葉粉末，密封待用。

2.2 標準溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品20 mg，加適量60%乙醇，水浴溶解后放冷，轉移到50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻。精密量取25 mL溶液，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液，濃度為0.2 mg/mL，儲存于4 ℃冰箱中備用。

2.3 標準曲線和回歸方程

精密量取蘆丁對照品溶液0.3 mL，0.6 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，3.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，在500 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，以標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1.求得回歸方程為y=10.790 0x-0.000 5，相對標準偏差R2= 0.999 9.

圖1 蘆丁標準曲線

2.4 沙棘葉總黃酮提取

稱取沙棘葉粉1.00 g，共3份，置于三角瓶中，分別加入60%乙醇溶液30 mL，超聲30 min，靜置過濾，收集濾液于100 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度。精密量取25 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.5 總黃酮含量的測定

精密量取供試品溶液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至6 mL；加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；之后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min.同時，取供試品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容，作為空白溶液。用紫外分光光度計于波長500 nm處測定樣品吸光度，按標準曲線計算樣品中總黃酮含量。

3 結果與分析

3.1 超聲功率對總黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復，結果取平均值)，1∶30的料液比，分別在100 W，80 W，60 W，40 W，20 W功率條件下，室溫超聲提取30 min，結果見圖2.

圖2 超聲功率對總黃酮提取率的影響

超聲波可以加速有效成分的釋放與溶出，提高有效成分的提取率。由圖2可知，隨著超聲功率的增高總黃酮提取率增大，當功率達到80 W時總黃酮提取率最高，功率達100 W時提取率不變。因此，從節約能耗考慮，適宜功率為80 W.

3.2 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復，結果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，分別在30 ℃(室溫)，40 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃溫度條件下超聲30 min，結果見第3頁圖3.

由圖3可知，溫度對沙棘葉總黃酮提取率有一定的影響，隨著水溫的升高提取率先增后減。當水溫由室溫升至40 ℃時，總黃酮提取率升高。當溫度超過40 ℃，總黃酮提取率有所降低，可能是強烈的熱效應會破壞沙棘葉中黃酮類化合物的緣故。溫度超過50 ℃之后，提取率變化比較平緩。故最佳提取溫度為40 ℃.

圖3 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

3.3 超聲時間對黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3次重復，結果取平均值)，1∶30的料液比，功率80 W，室溫下分別超聲提取5 min，10 min，15 min，20 min，30 min，結果見圖4.

圖4 超聲時間對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲時間對沙棘葉總黃酮的提取率影響較大，隨著超聲時間的延長總黃酮提取率先增加后持平。超聲時間20 min內總黃酮提取率增加比較明顯，呈上升趨勢。超過20 min后提取率無變化，說明超聲20 min黃酮全部溶出。因此，浸提時間宜選擇20 min.

3.4 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

稱取1.00 g沙棘葉粉15份(同一條件3個重復，結果取平均值)，分別加入40%，50%，60%，70%，80%乙醇水溶液30 mL，功率80 W，在室溫下超聲提取30 min，結果見圖5.

圖5 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，當乙醇濃度由40%增加到60%時，總黃酮提取率緩慢增加，大于60%后提取率極速下降。原因是乙醇濃度過低時不能完全溶解出黃酮類化合物，但當濃度過大時，又會阻礙黃酮類化合物的溶出。因此，選擇 60% 乙醇溶液為宜。

3.5 料液比對黃酮提取率的影響

稱取 1.00 g 沙棘葉粉 15 份(同一條件 3 個重復，結果取平均值)，分別加入 10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，30 mL 的 60% 乙醇水溶液，在功率 80 W，室溫條件下超聲提取 30 min，結果見圖 6.

圖6 料液比對總黃酮提取率的影響

由圖6可以看出，料液比對總黃酮提取率有一定的影響，當料液比升高時總黃酮提取率也會升高，但當料液比達到 1∶20后總黃酮提取率變化不大。原因是料液比較低時不易充分稀釋溶解出沙棘葉中的總黃酮，但當溶劑大于 1∶20 之后，會將雜質溶出。因此，選擇 1∶20 料液比較為合適。

3.6 正交試驗

根據上述單因素試驗的結果，全面考慮提取工藝條件對沙棘葉總黃酮提取率的相互影響，進行4因素3水平的正交試驗，以乙醇體積分數、超聲溫度、超聲時間、料液比為研究因素，以沙棘葉總黃酮提取率來確定超聲提取總黃酮的最佳工藝條件，因素水平設計見第4頁表1.根據正交試驗表操作，試驗結果見第4頁表2.

表1 正交試驗水平設計

表2 L9(34)正交試驗記錄及結果

由表1和表2可以看出，各因素對沙棘葉總黃酮提取率影響的大小順序依次為料液比(A)﹥超聲時間(C)﹥超聲溫度(D)﹥乙醇體積分數(B)。正交試驗最優水平為：A2B2C3D2，即料液比1∶20，乙醇體積分數60%，超聲時間20 min，超聲溫度40 ℃.

3.7 工藝條件驗證及結果

最佳工藝條件不在正交試驗中，為了確定優化條件的精密度與可靠性，進行驗證試驗。按照得出的最佳工藝條件，對沙棘葉中總黃酮進行了 3 次平行提取試驗，計算黃酮得率，結果如表 3 所示。

由表3可知，3次平均得率為5.97%，與正交試驗中處理 5的結果一致，說明室溫下也能得到較高的黃酮提取率。可能是由于超聲波振動產生的熱能，使水溫升高，加速了黃酮溶出。為節約能耗也可常溫下超聲提取。RSD值為0.97%，說明該結果可靠。

表3 沙棘葉黃酮測定結果

4 結論

試驗采用超聲波法提取沙棘葉總黃酮，以乙醇水溶液為提取劑，通過單因素與正交試驗考察了超聲功率、料液比、超聲時間、超聲溫度、乙醇體積分數等因素對沙棘葉中總黃酮提取率的影響。優化后的最佳工藝條件為料液比 1∶20，乙醇體積分數 60%，超聲時間 20 min，超聲溫度 40 ℃. 該方法不僅可保證沙棘葉總黃酮的生物活性，且具有操作簡單、提取速度快、耗能低、提取率高等優點，對實現工業化生產沙棘葉黃酮具有一定的參考價值。