小窩蛋白-1在白藜蘆醇治療小鼠急性肺損傷中的作用研究*

董雷，蔡宛如，馬春芳

[1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（浙江省新華醫(yī)院），浙江 杭州 310005；2.浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014]

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是呼吸系統(tǒng)危重疾病。ALI 早期受損傷最明顯的結(jié)構(gòu)是肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞，這些細胞損傷導(dǎo)致肺泡鈉水轉(zhuǎn)運失調(diào)，引起肺水腫及炎癥細胞聚集。近年來的研究表明，小窩蛋白（Caveolin, Cav）在肺泡上皮細胞屏障功能變化中扮演重要作用。本研究探討小窩蛋白-1（Cav-1）在ALI 小鼠中的變化情況以及白藜蘆醇作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實驗用雌性BALB/c 小鼠購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，體重（18±2）g。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，型號為E.coli.O55：B5, Sigma L-2880。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，Cav-1 單抗購自CST 美國公司。白藜蘆醇購自杭州沃森生物科技有限公司，過表達Cav-1 基因的重組慢病毒為前期實驗制備，且已在293T 細胞中驗證為過表達Cav-1。

1.2 動物分組及模型復(fù)制

BALB/c 小鼠共50 只，隨機分為正常組、ALI 組、ALI+ 白藜蘆醇干預(yù)組、Cav-1 過表達的ALI 組、Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預(yù)組，每組10 只。ALI 組采用小鼠霧化吸入異氟烷，麻醉后使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注，正常組使用生理鹽水氣管滴注。藜蘆醇干預(yù)組采用羥丙基β-環(huán)糊精包合后以生理鹽水溶解，在模型復(fù)制前4 天早晚使用30 mg/kg 劑量腹腔給藥。Cav-1 過表達的ALI 組在小鼠模型復(fù)制前1個月使用尾靜脈注射GV287-Cav-1 過表達載體5×108pfu/鼠，再使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注模型復(fù)制。Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預(yù)組在模型復(fù)制前1個月尾靜脈注射GV287-Cav-1 過表達載體5×108pfu/鼠，模型復(fù)制前4 天早晚用30 mg/kg 的白藜蘆醇腹腔注射，再使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注模型復(fù)制。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守倫理原則。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清TNF-α、IL-6 水平

模型復(fù)制后24 h 采用摘眼球處死法留取小鼠血清，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。參照試劑盒說明書操作檢測血清TNF-α、IL-6 水平。

1.4 免疫組織化學(xué)染色觀察Cav-1 小鼠在肺組織中的表達和分布

模型復(fù)制后24 h 處死小鼠，取肺臟組織用于免疫組織化學(xué)檢測肺臟Cav-1。肺組織標(biāo)本石蠟切片、脫蠟至水、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、加抗體后二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色。觀察肺組織標(biāo)本中彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫、肺泡上皮及肺組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞損傷等ALI 特征性病理改變，觀察Cav-1 小鼠在肺組織中的表達和分布情況。

1.5 Western blotting 檢測Cav-1 在肺組織中的表達

冰浴條件下取肺組織200 mg 通過細胞裂解液裂解，13 000 r/min 低溫離心5 min 后取上清液，采用BCA 法檢測蛋白含量，取50 μg 上樣量用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，400 mA 1.5 h轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，Cav-1 抗體（1 ∶1 000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1 ∶1 000）4℃孵育過夜。次日TBST（Tris-HCl 緩沖鹽溶液+吐溫）洗滌后，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1 ∶1 000）孵育2 h 后電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Cav-1 的表達

各組小鼠Cav-1 的表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.227，P=0.023）。與正常組小鼠Cav-1 表達水平（0.086±0.017）比較，ALI 組小鼠Cav-1 表達水平（0.214±0.018）升高（P＜0.05），ALI+白藜蘆醇干預(yù)組小鼠的Cav-1 表達水平（0.180± 0.022）較ALI 組降低（P＜0.05）。Cav-1 過表達的ALI 組中的Cav-1 表達水平（0.399±0.039）比ALI 組和ALI+白藜蘆醇干預(yù)組升高，而Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預(yù)組的Cav-1 表達水平（0.264±0.034）較Cav-1 過表達的ALI 組降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 過表達Cav-1 對小鼠肺組織病理的影響及白藜蘆醇的抑制作用

正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，Cav-1 定位在平滑肌細胞、肺泡細胞和血管內(nèi)皮細胞的細胞膜；ALI 組小鼠肺部出現(xiàn)水腫，肺泡間隔增寬，形態(tài)破壞，Cav-1的表達強于正常組（P＜0.05）；而經(jīng)白藜蘆醇處理后的ALI+白藜蘆醇干預(yù)組小鼠肺水腫較ALI 組小鼠減輕，肺泡形態(tài)較ALI 組小鼠有所好轉(zhuǎn)，Cav-1 表達較ALI 組有所降低（P＜0.05）；Cav-1 過表達的ALI 組小鼠肺水腫更加明顯，Cav-1 表達呈強陽性；Cav-1過表達的ALI+白藜蘆醇干預(yù)組小鼠中Cav-1 表達則較Cav-1 過表達的ALI 組降低。見圖2。

2.3 過表達Cav-1 對TNF-α、IL-6 的影響以及白藜蘆醇的作用

各組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，ALI 組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達升高（P＜0.05）；而ALI+白藜蘆醇組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達則較ALI 組降低（P＜0.05）。同時Cav-1 過表達的ALI 組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達較ALI 組升高（P＜0.05）；而Cav-1過表達的ALI 組+白藜蘆醇組小鼠血清TNF-α、IL-6的濃度比Cav-1過表達的ALI組降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組小鼠肺組織中Cav-1 的表達

圖2 各組小鼠肺組織病理及Cav-1 定位 （×400）

表1 各組小鼠血清中TNF-α 和IL-6 表達比較 （n =10，pg/ml）

3 討論

ALI 是臨床常見危重癥，通常由感染、創(chuàng)傷、休克等因素誘發(fā)。疾病早期是以彌漫性肺泡損傷、肺泡上皮細胞屏障功能破壞受損，激活肺內(nèi)多種炎癥細胞，啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致失控性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[1]。因此控制原發(fā)疾病和遏制炎癥反應(yīng)是防治ALI 的一種有效策略和方法。

Cav-1 是一個分子量為21～25 kD 的膜蛋白，是膜小窩的結(jié)構(gòu)性蛋白，廣泛存在于肺泡上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞、纖維細胞的細胞膜表面。長期以來，有關(guān)Cav-1 的研究主要集中在腫瘤轉(zhuǎn)移、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)等方面，在ALI/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病中的研究較為少見。有研究顯示，Cav-1 參與絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸 化[2-3]，而該信號通路影響著ALI 發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)，因此，筆者推測Cav-1 在ALI 發(fā)病機制的炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[4]，和LPS 誘導(dǎo)的ALI 野生型小鼠比較，Cav-1 基因敲除小鼠可通過內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOs）途徑抑制NF-κB 的活性，減少炎癥細胞因子的合成與分泌。然而另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞中Cav-1 能與Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）相互作用并經(jīng)血紅素氧化酶-1 途徑抑制TLR4 相關(guān)信號傳導(dǎo)而減輕ALI 病變程度[5-6]。該研究發(fā)現(xiàn)，高表達的Cav-1 能在LPS 的誘導(dǎo)下分泌更多的炎癥因子，加重肺部炎癥損傷。

目前，隨著炎癥機制深入研究，中藥及其有效成分的抗炎效果引起越來越多研究者的注意，其安全可靠、物美價廉，成為繼非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類抗炎藥后又一類廣泛應(yīng)用的抗炎中藥[7]。白藜蘆醇，一種多酚類化合物，存在于多種中藥如虎杖、藜蘆中，目前已證實具有清除自由基、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[8]。有研究表明，白藜蘆醇能降低細胞中TLR4 的表達和抑制PI3K 和NF-κB 的磷酸化。本研究中，白藜蘆醇干預(yù)后能抑制ALI 小鼠中TNF-α 和IL-6 的表達水平，在高表達Cav-1 的小鼠ALI 中，白藜蘆醇同樣能下調(diào)小鼠中炎癥因子TNF-α和IL-6 的表達，減輕肺組織炎癥反應(yīng)，其機制與降低Cav-1 的表達密切相關(guān)。為臨床早期防治ALI 提供新思路和新選擇。