EGFR靶向性MRI探針的制備及其與NSCC細胞靶向結合的研究*

劉成，李爍，張全明

（深圳市南山區人民醫院 耳鼻喉科，廣東 深圳 518000）

鼻咽部鱗狀細胞癌（nasopharyngeal squamous cell carcinoma, NSCC）早期診斷困難，大多數診斷時已到晚期，錯過手術最佳時機，患者的5年病死率較高，接近30%[1-2]。負載顯影劑、靶向因子和化療藥物的多功能分子影像探針是腫瘤治療研究的熱點及難點，目前關于NSCC靶向顯影與治療多功能載體的研究較少[3-4]。本研究擬利用NSCC 表面表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）作為靶受體，構建EGFR靶向性的MRI 探針，從體外細胞水平探討探針與NSCC 細胞靶向結合，為NSCC 早期診治提供思路和技術參考[5-6]。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料與試劑

NSCC 和正常鼻咽細胞系由中南大學腫瘤研究所曹亞教授提供，超小型超順磁性氧化鐵（USPIO）[TANBead ? USPIO-101（臺灣先進納米科技股份有限公司）核心為四氧化三鐵Fe3O4納米顆粒（Fe 濃度為 10 mg/ml），大小為6～10 nm，pH 值為（3.8±0.5）]，阿霉素（北京百奧萊博科技有限公司，HPLC ≥ 99.0%），西妥昔單抗（Cetuximab, CET，德國默克里昂制藥公司，規格100 mg ∶50 ml），甲醇分析純（上海國藥集團化學試劑有限公司），碳化二亞胺鹽酸鹽EDC·HCl（上海品純試劑有限公司），明膠和核固紅染料（武漢博士德公司），標準鐵溶液（GBW08616，1 000 μg/ml）（北京國家標準物質研究中心），亞鐵氰化鉀分析純（天津市化學試劑三廠），胰酶、EDTA（美國Amresco 公司）。

1.2 主要設備

光學顯微鏡（日本Olympus 公司），免疫熒光顯微鏡（同濟醫院公共實驗室），磁性分離器（臺灣先進納米科技股份有限公司），4.7 T/30 cm 小動物磁共振成像儀（德國Bruker Biospec 公司），普通細胞培養箱（美國科俊儀器有限公司），JP-C50 型超聲波振蕩儀（廣州市吉普超聲波電子設備有限公司），JI80-2 型臺式離心機（武漢市首義醫療器械廠），HPIAS21000 型全自動醫學彩色圖像分析系統（武漢華中科技大學同濟醫學院病理教研室）。

1.3 方法

1.3.1 EGFR 靶向性MRI 探針的制備 將萘、鉀和丙烯醇溶解于四氫呋喃溶液，然后加入環氧乙烷及正己烷，利用陰離子開環聚合反應合成一端為烯丙基另一端為羥基的聚乙二醇（Allyl-PEG-OH），通過烯丙基聚乙二醇的羥基端引發己內酯開環聚合為烯丙基聚乙二醇聚己內酯共聚物（Allyl-PEG-PCl），利用烯丙基和2-氨基乙基硫醇鹽酸鹽的水相加成將烯丙基轉化為氨基，得到α-氨基聚乙二醇聚己內酯共聚物（NH2-PEGPCl），用葉酸修飾得到葉酸功能化的聚乙二醇聚己內酯共聚物（Fa-PEG-PCl）[7]。合成疏水型Fe3O4納米粒子（SPION），將疏水型Fe3O4納米粒子表面改性，制備親水 型Fe3O4納米粒子（WSPIO），加入阿霉素（2mg/ml）376μl 混勻，后加入7.52mg EDC·HCl，然后采用溶劑揮發法制備負載超順磁性氧化鐵（SPIO）的聚合物膠束，得到表面親水、內部疏水的EGFR 靶向性MRI 探針。

1.3.2 EGFR 靶向性MRI 探針理化特性的分析 探針的表征包括：粒徑、SPIO 和阿霉素（Doxorubicin, DOX）負載率、弛豫率。應用透射電子顯微鏡（trans-mission electron microscope, TEM）測量探針的粒徑，采用原子吸收法測定SPIO 的含量，將已知重量的SPIO 分散到1 mol/L HCl 溶液中，使SPIO 分解為鐵離子并溶解在溶液中，根據已經建立的標準曲線，測定280 nm處的吸收 得到DOX 的負載，測定248.3 nm 處的吸收，計算出鐵含量，用氧化鐵的質量除以膠束的總質量，得到SPIO 的負載率。通過MR 掃描儀行常規T2和T2maping 序列成像，掃描參數設置：回波時間分別取8.50、17.00、25.50、34.00、42.50、51.00、59.50 及68.00 ms，重復時間1 055 ms，視野10 cm×10 cm，層厚與層間距均為5 mm，矩陣256×256。觀察T2信號強度在探針溶液不同濃度（0、0.10、0.30、0.60、0.90、1.80 nmol/L）下的改變情況，獲得1/T2值，計算弛豫率。

1.3.3 NSCC 的培養 在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕 度下，采用RPMI 1640 培養液[含青霉素鈉（100u/ml）、鏈霉素（100u/ml）及小牛血清（100μg/m1）]進行NSCC 和正常鼻咽細胞傳代培養。

1.3.4 普魯士藍染色 將SPIO 濃度分別為5、10、20、40 和80μg/ml 的EGFR 靶向性MRI 探針分別與NSCC 細胞及正常鼻咽細胞（細胞計數5×105個）在RPMI 1640 培養液中共孵育1h，之后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，用4%戊二醛固定10min，采用普魯士藍反應液孵育30min，蒸餾水洗3 次，伊紅（0.5%）復染3min，顯微鏡下觀察Fe 染色情況[8]。

1.3.5 間接免疫熒光檢測 將等量NSCC 細胞接種在24 孔板中，并培養1d。當NSCC 細胞鋪滿玻片時，采用冰甲醇進行固定，10min 后采用PBS 洗玻片3 次，正常兔血清室溫封閉。40min 后，向各玻片分別加入EGFR 靶向性MRI 探針、西妥昔單抗及PBS。置入4℃濕盒1d。次日采用PBS 洗玻片3 次，加入含有FITC標記的兔抗人IgG（避光），室溫孵育。采用Hoechst 33258 避光染色，采用PBS 洗玻片3 次，脫水、封片、熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 細胞的MRI 腫瘤磁敏感成像 在RPMI 1640培養液中加入EGFR 靶向性MRI 探針（SPIO 分別為0、5、10、20、40 和80 μg/ml）分 別與NSCC 細胞及正常鼻咽細胞孵育1 h，消化、洗滌、重懸細胞，置于1.5ml Ependoff 管中采用MRI 掃描[9]。采用Philips Intera 3T MRI 系統，環形表面線圈（C3 線圈）行軸面及冠狀面掃描，T2WI 采用快速自旋回波（FSE）系列，TE 100 ms，TR 1 600 ms，層厚1.5 mm，矩陣384× 512，4 次激勵。選擇相似的感興趣區測量6個信號強度，計算信號變化率（△SI），△SI=[（SIL-SIU）/SIU]×100%，SIL 為EGFR 靶向性MRI 探針與細胞共孵育后的信號強度，SIU 為細胞信號強度。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR 靶向性MRI 探針的理化特性

EGFR 靶向性MRI 探針的粒徑為（77.0±1.5）nm，SPIO 負載率為（306.0±4.9）μg/ml，DOX 負載率為（103.3±3.1）μg/ml，弛豫率為（110.4±2.9），提示EGFR 靶向性MRI 探針制備成功。見圖1、2。

2.2 普魯士藍染色結果

EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細胞共孵育后，細胞內可見不同量的藍色Fe 顆粒，隨著SPIO 濃度的升高而增多；EGFR 靶向性MRI 探針與正常鼻咽細胞共孵育，細胞內未見明顯Fe 顆粒存在。見圖3。

2.3 EGFR 靶向性MRI 探針對NSCC 細胞的免疫結合活性

西妥昔單抗（陽性對照）在NSCC 細胞膜有強烈的綠色熒光表達，陰性對照呈現很微弱的綠色熒光表達，EGFR 靶向性MRI 探針與西妥昔單抗熒光強度相近。見圖4。

圖1 EGFR 靶向MRI 探針的TEM 圖 （×200）

圖2 馳豫曲線

圖3 NSCC 細胞內可見不同量的藍色Fe 顆粒 （普魯士藍染色×200）

圖4 3 組NSCC 細胞內不同的綠色熒光表達 （Hoechst 33258 染色×200）

2.4 體外MRI

隨濃度0、5、10、20、40 和80 mg/ml 梯度升高，EGFR 靶向性MRI 探針T1信號基本無變化，EGFR 靶向性MRI 探針T2信號強度逐漸減弱，EGFR 靶向性MRI 探針在20、40 和80 mg/ml 3個濃度點比較，T2信號強度明顯下降，其中80 mg/ml T2信號強度下降最顯著（見圖5）。EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細胞共孵育后MRI 信號在T2WI 上有不同程度的減低（P＜ 0.05），SPIO 濃度越高MRI 信號強度減弱越明顯（P＜ 0.05）。見表1。

圖5 體外MRI

表1 不同濃度SPIO 與NSCC 細胞孵育后在T2WI 上信號變化情況比較 （±s）

表1 不同濃度SPIO 與NSCC 細胞孵育后在T2WI 上信號變化情況比較 （±s）

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3 討論

NSCC 發病機制尚不明確，是臨床常見的耳鼻咽喉惡性腫瘤之一[10-12]。臨床上，放療是NSCC 治療的主要手段。研究表明，單純放療治療各期NSCC 的5年總生存率可達70%。為此，制定合理的放療靶區是提高NSCC 治愈率的關鍵因素。MRI 具有良好的軟組織對比性及空間分辨率，能較好地診斷NSCC，但常規的MRI 常用的造影劑釓（Gd-DTPA）未分布在特殊的靶向器官，只對T1信號增強，并未能顯示亞臨床病灶。USPIO 是一種粒徑小、具有超順磁性、敏感性高、毒性低和生物可降解的新型磁性納米生物材料，常用于惡性腫瘤的影像診斷中。相關研究表明，NSCC 的EGFR 表達水平≥85%[13]。EGFR 是一種已知分子量為170～180 kD 的糖蛋白單體，其與配基結合后，可提高絡氨酸激酶活性，從而吸引具有SH2 區域的信號分子，進而啟動細胞分裂、信號傳遞、DNA 復制、基因轉錄等一系列變化，具有促進細胞增殖、黏附、侵襲及其轉移，進而誘導形成腫瘤的作用[14]。因此，制備EGFR 靶向性MRI 探針對高表達EGFR 的NSCC 進行MRI 免疫顯像理論上是可行的。

本研究自行制備EGFR 靶向性MRI 探針，觀察其對EGFR 表達陽性的NSCC 細胞的主動靶向作用，即配體介導、位點特異性的納米復合物在腫瘤細胞中的聚集，探討靶向性。將不同濃度SPIO 的EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細胞孵育，通過普魯士藍染色、間接免疫熒光和MRI 觀察NSCC 細胞對EGFR 靶向性MRI 探針的攝取情況，結果顯示，普魯士藍染色證實EGFR 靶向性MRI 探針對NSCC 細胞的靶向攝取依賴于SPIO 濃度，西妥昔單抗（陽性對照）在NSCC細胞膜有強烈的綠色熒光表達，陰性對照呈現很微弱的綠色熒光表達，提示陽性對照NSCC 細胞膜EGFR高表達，陰性對照是非特異性結合導致；EGFR 靶向性MRI 探針細胞膜有強烈的綠色熒光表達，EGFR 靶向性MRI 探針組與西妥昔單抗熒光強度相近，說明EGFR 靶向性MRI 探針有良好的免疫活性和結合活性，EGFR 靶向性MRI 探針可特異性結合進入NSCC細胞內，從而降低MRI T2信號強度。

綜上所述，EGFR 靶向性MRI 探針的粒徑小，可降低MRI 的T2信號強度，具有高度的靶向性。EGFR靶向性MRI 探針為NSCC 的早期準確診斷和治療提供新的思路和技術，其NSCC 體內示蹤有利于復發、轉移病灶的早期檢出，可在準確診斷的同時進行聯合化療，值得推廣。