大蒜抗根結(jié)線蟲內(nèi)生細(xì)菌的篩選及盆栽防效試驗(yàn)

黃開偉，李敏敏，史倩倩

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2. 山東省植物保護(hù)總站，山東 濟(jì)南 250100）

根結(jié)線蟲病是如今設(shè)施農(nóng)業(yè)中重要的土傳病害之一，每年在全球范圍內(nèi)造成的損失高達(dá)1 000 億美元[1-3]。根結(jié)線蟲寄主范圍十分廣泛，大部分農(nóng)作物都可以成功侵染，嚴(yán)重時(shí)作物減產(chǎn)高達(dá)75%以上。利用稀釋涂布平板法從受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須組織研磨液中進(jìn)行根結(jié)線蟲生防細(xì)菌的篩選，并得到一株對(duì)根結(jié)線蟲具有較好防治效果的芽孢桿菌菌株，為根結(jié)線蟲的生物防治提供了資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品

山東青島采集的受根結(jié)線蟲為害的大蒜樣品。

1.1.2 供試線蟲

南方根結(jié)線蟲，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院線蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 LB 固體培養(yǎng)基（LBA） 培養(yǎng)基配方胰蛋白胨5 g，酵母抽提物2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉7.5 g，蒸餾水定容至500 mL，pH 值7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防細(xì)菌的分離

稱取受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須10 g，用1%的次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水漂洗3 遍，放入滅菌研缽中研磨成糊狀，然后用少量無菌水洗入裝有90 mL 無菌水的三角瓶中；充分混勻后靜置10 min；吸取100 μL 稀釋液均勻涂布在LBA 培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d；挑取形態(tài)不一樣的單菌落用平板劃線法分離純化，將得到的菌株轉(zhuǎn)接到LBA 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)24 h，于4 ℃下進(jìn)行保存。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲懸浮液制備

從南方根結(jié)線蟲的空心菜上挑取成熟的線蟲卵塊，用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min，無菌水沖洗干凈。將卵塊收集到滅菌培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水，于28 ℃下恒溫孵化，48 h 后收集孵化的線蟲，備用。

1.2.3 生防細(xì)菌的篩選

挑取4 ℃保存于LBA 培養(yǎng)基斜面的菌株，于LBA 平板上劃線、活化，1 d 后挑取單菌落轉(zhuǎn)接到裝有100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速9 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。取24 孔板向其中加入1 mL 上清液，對(duì)照組加等量無菌水，挑入大約50 條線蟲，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)，記錄24 h后線蟲死亡數(shù)，計(jì)算線蟲的校正死亡率。篩選出對(duì)南方根結(jié)線蟲觸殺效果強(qiáng)的生防菌株。

校正死亡率=

為了避免建筑電氣線路受到破壞，需要加強(qiáng)對(duì)建筑電氣線路設(shè)計(jì)和安裝方案的設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)工作中，需要遵循相應(yīng)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，確保設(shè)計(jì)方案的合理和安全。例如，在建筑電氣線路安裝中，為了避免建筑電氣線路出現(xiàn)漏電的情況，工作人員需要在線路相應(yīng)的位置安裝斷路器，降低用戶問題的發(fā)生概率。完善的建筑電氣線路設(shè)計(jì)和安裝方案不僅可以有效降低電氣線路的負(fù)荷，而且可以降低因電氣線路的問題導(dǎo)致的安全事故。

1.2.4 生防菌形態(tài)觀察

將對(duì)根結(jié)線蟲直接觸殺效果良好的細(xì)菌在LBA培養(yǎng)基平板上劃線，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的單菌落形態(tài)，再對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.5 生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》8 與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》9 對(duì)篩選出來的根結(jié)線蟲觸殺效果良好的生防細(xì)菌進(jìn)行伏-普試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.2.6 細(xì)菌DNA 的提取及16 SrDNA 基因序列分析

利用OmegaBio-Tek 試劑盒提取生防芽孢桿菌的DNA；采用16 SrDNA 細(xì)菌通用引物27F/1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：10X Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物27F/1492R 各1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 16 μL，模板DNA 2 μL；反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s。63 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min；4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)過NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.7 根結(jié)線蟲生防細(xì)菌盆栽防效試驗(yàn)

待供試番茄（麗春） 長(zhǎng)出第4 片真葉后，進(jìn)行細(xì)菌發(fā)酵液的制備，菌體濃度最終調(diào)成1×107/mL。在處理組番茄根部澆20 mL 生防菌發(fā)酵液，對(duì)照番茄根部?jī)H澆灌無菌水。3 d 后，在番茄根部均勻接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（1 000 條/株），每個(gè)處理20 棵番茄，接種37 d 后調(diào)查番茄發(fā)病情況，參考Bridge 和Page 的方法對(duì)根結(jié)分級(jí)[4]，統(tǒng)計(jì)番茄的根結(jié)數(shù)和病情指數(shù)計(jì)算出防效。

根結(jié)線蟲的根結(jié)分級(jí)判定見表1。

表1 根結(jié)線蟲的根結(jié)分級(jí)判定

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗線蟲生防細(xì)菌篩選結(jié)果

通過稀釋涂布平板法初步分離出102 株細(xì)菌，再通過南方根結(jié)線蟲直接觸殺試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩得到4 株對(duì)南方根結(jié)線蟲生防效果較好的細(xì)菌。其中，S1-1 菌株于37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)48 h 后其發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的致死率達(dá)到90.08%。

生防菌發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的觸殺防效見表2。

表2 生防菌發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的觸殺防效

2.2 菌株S1-1 的形態(tài)特征

S1-1 在LB 培養(yǎng)基上菌落顏色為污白色，菌落形狀呈雜草狀散生，在10%的NaCl 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形、邊緣較整齊、表面光滑、菌落不隆起、不透明、培養(yǎng)基顏色未見明顯變化。經(jīng)革蘭氏染色后，菌株形態(tài)為桿狀，呈紫紅色，因此S1-1 是革蘭氏陽性菌。

2.3 菌株S1-1 的生理生化特征

芽孢桿菌DR2-1 和S1-1 的生理生化特性見表3。

2.4 菌株S1-1 基因序列分析結(jié)果

對(duì)菌株S1-1 的16S rDNA 基因序列用Blast 進(jìn)行序列比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，菌株S1-1 與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus） 屬同一個(gè)分支，結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，可以鑒定菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

表3 芽孢桿菌DR2-1 和S1-1 的生理生化特性

2.5 菌株S1-1 對(duì)南方根結(jié)線蟲的防效測(cè)定

通過盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定菌株S1-1 對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治效果。結(jié)果表明，施用菌株S1-1 的發(fā)酵液后，處理組番茄根結(jié)數(shù)目及病情指數(shù)明顯低于對(duì)照組，防治效果達(dá)到74.86%，表明菌株S1-1 對(duì)南方根結(jié)線蟲具有良好的防治作用。

南方根結(jié)線蟲盆栽試驗(yàn)見表4。

3 結(jié)論

從受根結(jié)線蟲為害的大蒜根須中共分離出4 株對(duì)南方根結(jié)線蟲直接觸殺效果較好的生防細(xì)菌。盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株S1-1 對(duì)南方根結(jié)線蟲具有良好防效。結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

表4 南方根結(jié)線蟲盆栽試驗(yàn)