去泛素化酶在巨大兒胎盤中的表達及調控機制

隨著我國經濟水平發展及人們生活水平不斷改善，巨大兒的發生率大幅度增加，不僅增加了妊娠期糖尿病、剖宮產、嬰兒死亡等風險，而且對子代遠期健康造成不良影響[1]。探討巨大兒發生的分子機制，將成年代謝疾病的防控節點提前，具有非常重要的意義。胎兒生長發育所需的一切營養物質都是由母體通過胎盤供應，胎盤細胞的生長發育類似腫瘤細胞，常常被稱作“偽腫瘤”[2]。去泛素化酶（Ubiquitin specific protease 2a，USP2a）與細胞增殖和凋亡有關，參與腫瘤細胞周期調控[3]。但USP2a與巨大兒發生的相關研究國內外尚未見報道。本研究旨在通過分析USP2a在巨大兒胎盤中的作用，為探討巨大兒的發病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 采用病例對照研究，經我院倫理委員會批準，孕婦簽署知情同意書。選擇我院2014年9月～2015年6月分娩的非糖尿病性巨大兒29例（巨大兒組），另選擇同期住院足月分娩正常體重兒31例（正常兒組），采集產婦胎盤樣本。兩組孕婦年齡、孕前BMI、分娩孕周差異無統計學意義（P>0.05），排除混雜因素。所有研究對象均為單胎初產，無肝炎、結核等急慢性傳染病史，無心臟病、甲亢、肝腎疾病等內科疾病，常規產檢，在孕24～28周進行75g OGTT檢查，以排除妊娠期糖尿病等其他妊娠合并癥和并發癥。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 無菌條件下，胎盤娩出后5min內，在胎盤母體面中央避開出血、梗死及鈣化區取絨毛組織1cm×1cm×1cm，生理鹽水沖洗干凈后置于無菌凍存管內，置液氮中保存。

1.2.2 ELISA實驗 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測USP2a、MDM2、P53蛋白的表達，試劑盒購自上海滬宇生物科技有限公司，實驗步驟按照說明書進行。

1.2.3 Real Time PCR檢測選擇USP2a下游底物MDM2、CCND1及FASN進行qPCR驗證。①引物及探針的設計和合成：用Primer Premier 5.0軟件設計GAPDH、MDM2、CCND1及FASN的 引物和 探針，委托擎科生物技術有限公司合成，經實驗驗證能擴增目的基因后采用。引物及探針序列（5′-3′）。②胎盤組織中RNA的提取：取出保存的胎盤組織，每次剪取100mg左右，置入研缽中，倒入液氮研磨；研磨至粉狀，加入1ml TRIzol，然后根據總RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度與純度，-70℃保存。③逆轉錄：用Takara RR036TA逆轉錄試劑盒在T100 thermal cycler儀器中進行逆轉錄反應，反應體系核酸500ng，MIX 2μl，加水補充到10ml，反應條件：37℃ 15min，85℃ 5s，逆轉完畢后補充190μl的無酶水，4℃保存。④Real Time PCR：所有Real Time PCR反應均在Roche LightCycler 480Ⅱ儀上進行，每一個標本均做3個復孔，每次反應都帶入標準品。PCR反應體系為：SYBR 2.5μl、前引物0.1μl、后引物0.1μl、ROX 0.1μl、無酶水1.7μl，混勻后取4μl加入384孔板，再取1μl的cDNA加入384孔板中，形成5μl的體系。⑤數據分析：根據擴增曲線，由SDS2.4軟件系統輸出得到每個PCR循環反應的閾值，即模板cDNA擴增達到某一熒光強度的循環次數，每個樣本檢測重復3次，取其平均值，其中檢測基因表達時GAPDH作為內參，用來校正濃度差異引起的誤差。

1.3 統計學方法 采用Stata 10.0軟件進行數據分析，定量資料用均數±標準差（±s）描述，符合正態分布的組間比較采用t檢驗；而呈偏態分布的組間比較采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。數據作圖采用GraphPad Prism 5.0。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較 兩組孕婦年齡、分娩孕周等差異無統計學意義（P>0.05），兩組胎兒體重有統計學差異（P<0.05），見表1。

表1 兩組一般情況比較（±s）

表1 兩組一般情況比較（±s）

項目 巨大兒組 對照組 t/z P例數 29 31孕婦年齡（歲） 26.76±3.46 26.10±2.71 0.820 0.420孕前BMI（kg/m2）20.93±4.59 19.73±1.91 1.312 0.200分娩孕周（周） 39.63±0.62 39.60±1.08 0.170 0.870孕次（次） 1.38±0.86 1.19±0.48 1.030 0.312新生兒性別 1.791 0.181男19 15女10 16新生兒出生體重（g） 4280.69±319.35 3330.00±321.55 11.480＜0.05

2.2 兩組孕婦胎盤中USP2a、MDM2及P53蛋白含量比較 經過ELISA檢測，巨大兒胎盤中USP2a蛋白含量高于正常體重兒，差異有統計學意義（Z=1.990，P=0.047）。經過ELISA檢測，巨大兒胎盤中MDM2蛋白含量高于對照組，而P53蛋白含量低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組胎盤中USP2a、MDM2、P53蛋白含量比較（±s）

表2 兩組胎盤中USP2a、MDM2、P53蛋白含量比較（±s）

蛋白 巨大兒組 對照組 Z P USP2a 1863.74±637.57 1573.77±421.449 1.990 0.047 MDM2 60.80±28.15 46.84±12.77 2.160 0.027 P53 292.04±297.32 627.48±709.58 -2.040 0.042

2.3 兩組孕婦胎盤中MDM2、CCND1及FASN mRNA水平比較 巨大兒組胎盤中MDM2表達水平高于對照組，差異有統計學意義（Z=-2.025，P=0.043），而CCND1及FASN表達差異無統計學意義（Z=-0.500，P=0.617；Z=-1.202，P=0.229），見圖1。

圖1 兩組胎盤中MDM2、CCND1及FASN mRNA表達情況

3 討論

泛素化及去泛素化是機體生命進程中必不可少的翻譯后修飾過程，蛋白經泛素化修飾后被降解，去泛素化酶則能逆轉泛素化過程使蛋白免受降解[4]。USP2基因位于人類染色體11q23.3，是一種重要的去泛素化酶，通過特異性識別靶蛋白，使靶蛋白去泛素化并阻礙其降解，與細胞增殖和凋亡有關，參與細胞周期調控[5]。USP2具有3個亞型，其中USP2a能對腫瘤細胞進行周期調控[6]。胎盤細胞的生長發育類似腫瘤細胞，常常被稱作“偽腫瘤”，USP2a對腫瘤細胞周期的調控作用提示USP2a可能也調控胎盤細胞的增殖、凋亡和浸潤，影響胎盤、胎兒的生長發育。目前國內外未見USP2a與巨大兒關系的研究報道。我們檢測巨大兒胎盤中USP2a的蛋白表達水平，研究結果顯示，與對照組相比，巨大兒胎盤中USP2a蛋白表達水平上調，提示胎盤中USP2a與巨大兒發生有關。

研究證實USP2a通過特異性識別靶蛋白（底物），使靶蛋白去泛素化并阻礙其降解[6]。常見的靶蛋白底物有脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthetase，FASN），泛素蛋白連接酶（Murine Double Minute 2，MDM2），細胞周期蛋白D1（Cyclin-D1，CCND1）等。研究表明在前列腺癌中FASN的蛋白水平是通過USP2a去泛素化調控，從而激活細胞程序性死亡[7]。作為一種癌基因，USP2a異位表達最終改變MDM2的穩定性[8]。Kim等[9]發現在膀胱癌細胞中USP2a加速CCND1降解從而導致細胞周期停滯。基于上述實驗理論，我們選擇USP2a下游底物MDM2、CCND1及FASN進行qPCR驗證，結果發現巨大兒胎盤中MDM2表達水平高于正常兒，而CCND1及FASN表達并無差異。我們推斷，在巨大兒胎盤中USP2a可能通過去泛素化作用，特異性識別靶蛋白MDM2，抑制MDM2降解。

MDM2-P53是機體內一種重要的作用模式，同時MDM2是USP2a底物之一。而MDM2同時也是P53的泛素連接酶，因此MDM2的增多又促進了P53的泛素化及降解，最終導致P53誘導胎盤滋養細胞凋亡減少，胎盤過度生長，巨大兒發生。而且進一步的實驗也驗證了我們的假設，結果顯示巨大兒胎盤中MDM2蛋白表達增高，P53蛋白表達降低。

近年來多個腫瘤耐藥研究中心發現USP2a能夠減少腫瘤細胞的凋亡，從而使其對許多化療藥物產生耐藥性[10]。研究發現USP2a在體內與MDM2相關。在腫瘤來源的細胞系中用siRNA干擾USP2a轉染后導致P53蛋白增加與P53靶基因的表達上調[8]。P53作為基因組衛士發揮阻滯細胞周期、促進細胞凋亡及基因組穩定性的作用。如MDM2結合P53使其失活，導致正常生物學功能喪失。USP2a-MDM2-P53通路在腫瘤方面的研究結果也從另一方面支持我們的假設，后期我們還將在胎盤滋養細胞系中通過體外實驗進一步驗證。

綜上所述，胎盤中USP2a表達上調通過MDM2-P53通路參與巨大兒發生，本研究結果為巨大兒的研究提供新思路，并為臨床巨大兒防治提供理論依據。尋找特異性阻斷MDM2與USP2a之間相互作用的小分子多肽，可能有助于指導臨床有效干預巨大兒的發生。