鹽酸多奈哌齊對阿爾茨海默病大鼠的影響

梁搏納

(吉林省人民醫院神經內科，吉林 長春 130021)

阿爾茨海默病(AD)是一種較為常見的腦變性疾病，其確切的病理損傷機制仍尚未清楚。目前，已明確AD患者的學習記憶功能減退可能是由于腦內的膽堿能神經元功能受損而造成的〔1〕?；诖?，有學者認為〔2〕：鹽酸多奈哌齊治療AD具有較好的療效，但對于其作用機制仍需進一步研究。另外也有研究〔3〕證實了：淀粉樣β蛋白(Aβ)沉積，破壞了突觸完整性，影響了其功能和可塑性。突觸致密區蛋白95蛋白是突觸后致密區內含量最多的一種蛋白，在突觸可塑性中發揮著重要作用。但對于鹽酸多奈哌齊是否會影響突觸可塑性尚無學者進行研究。本研究以動物模型為研究對象，探討了鹽酸多奈哌齊對AD大鼠上述因子的影響，以便為AD的治療提供一種較為有效的治療藥物。

1 材料與方法

1.1材料及分組 以18只正常老年雄性Wistar大鼠〔匯智泰康生物技術(北京)有限公司提供，許可證編號：SYXK(京)2014-0022〕為研究對象，均為19～24月齡，體重450～550 g，平均(502.3±12.5)g。將18只大鼠隨機分為3組，分別為對照組、模型組及治療組，每組6只。實驗過程中動物可自由攝食及飲水。

1.2試劑與儀器 上海北諾生物科技有限公司的Aβ25～35，上海寶曼生物科技有限公司的碘化丙啶(PI)染色液，賽默飛公司的核糖核酸酶(RNase)、兔抗大鼠Aβ1～40、 丙二醛(MDA)試劑盒、羊抗兔的二抗，索萊寶公司的乙酰膽堿酯酶(AchE)、丁酰膽堿酯酶(BchE)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，檸檬酸三鈉還原硝酸銀(AgNO3)，北京諾博萊德科技有限公司提供的中杉金橋PV9000通用型二步法檢測試劑盒，北京梅科萬德生物科技有限公司提供的DAB顯色劑，香港西夏公司提供的圖像分析儀(軟件系統Visilog5.0)，沈陽譽德電子儀器有限公司提供的SYD-K4080型全自動恒溫冷凍切片機；先儀譜科技提供腦立體定位儀，江蘇賽昂斯公司提供的Morris水迷宮。

1.3建立模型 制備聚集態的Aβ后，模型組和治療組建立AD模型：適應性喂養1 w，100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于腦立體定向儀，減去頭頂部毛發，碘酊消毒，75%酒精脫碘，頭頂部正中切口，暴露前囟，依據定位圖譜，鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器穿刺，注入5 μl聚集態的Aβ25～35，留針10 min，局部撒復方新諾明，縫合切口，碘伏消毒。大鼠術后愈合后，給予3%氯化鋁100 mg/kg灌胃，持續1個月。

對照組同上步驟，不同的是注射器注入等容積的生理鹽水。

1.4方法 3組大鼠在造模后3 d開始灌胃給藥，1次/d，治療組給予鹽酸多奈哌齊(商品名：阿瑞斯，廠家：陜西方舟制藥有限公司；批準文號：國藥準字H20030583)0.525 g/kg，對照組及模型組給予等量的生理鹽水灌胃。連續灌胃4 w。

1.5觀察指標

1.5.1學習能力及空間記憶能力 在灌胃結束后，以大鼠Morris水迷宮實驗測試分析〔4〕，包括學習能力、空間記憶能力，空間探索實驗。

1.5.2血清AchE、BchE活性 麻醉，腹主動脈取血3 ml，離心，取血清測定AchE、BchE活性。

1.5.3腦組織中SOD、MDA含量及細胞凋亡情況 麻醉取血，快速斷頭，取出全腦，分離大鼠大腦右側后1/4皮質，稱重，生理鹽水制成腦組織勻漿(10%)，按照試劑盒測定SOD、MDA含量。

取出全腦，分離大鼠大腦右側前1/4皮質，浸泡冰乙醇(70%)中，制成單細胞懸液，PI染色，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5.4不同腦組織區域的Aβ表達 取出全腦，將左側額葉、顳葉和海馬組織浸泡至甲醛溶液(10%)中，石蠟包埋、切片，Aβ免疫組化和銀染色。

1.5.5大鼠腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95表達變化 觀察所有大鼠腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95陽性細胞：免疫組化切片，10×10顯微鏡觀察，Visilog5.0 by Noesis軟件采集并分析圖像，記錄陽性細胞平均面積及平均吸光度。

1.6統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、Fisher確切概率法。

2 結 果

2.13組學習能力及空間記憶能力比較 在第1～4天，治療組、對照組逃避潛伏期均明顯短于模型組，而治療組、對照組空間探索實驗結果明顯低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.23組血清AchE、BchE活性比較 對照組、治療組血清AchE活性均顯著低于模型組(P<0.05)，對照組BchE活性顯著低于模型組(P<0.05)，治療組、模型組BchE活性無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.33組腦組織中SOD、MDA含量及細胞凋亡情況比較 治療組、對照組腦組織中SOD含量顯著高于模型組，MDA含量及細胞凋亡情況顯著低于模型組(P<0.05)，見表3。

表1 3組學習能力及空間記憶能力比較

與模型組相比:1)P<0.05；下表同

表2 3組血清AchE、BchE活性比較

表3 3組腦組織中SOD、MDA含量及細胞凋亡情況比較

2.43組左側額葉、顳葉和海馬組織區域的Aβ表達量比較 治療組、對照組左側額葉、顳葉和海馬組織區域的Aβ表達量顯著低于模型組(P<0.05)，見表4。

2.53組腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95表達比較 治療組、對照組腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95表達顯著高于模型組(P<0.05)，見表5。

表4 3組左側額葉、顳葉和海馬區域的Aβ表達量比較

表5 3組腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95表達比較

3 討 論

AD的流行病學顯示〔5〕：我國65歲以上老年人有3%～7%的人群患病。其病因尚未明確，但有研究發現〔6〕：AD的典型組織病理學改變為腦內的淀粉樣蛋白沉積，而中樞膽堿能神經元功能受損可能會導致患者的學習、記憶受損。鹽酸多奈哌齊是一種AchE抑制劑，能夠改善AD的學習、記憶功能，但對于其作用機制尚未明確。

本研究建模及干預方式與何建明等〔7〕相一致。本研究結果表明，AD能夠導致大鼠體內的AchE活性升高，而治療組之所以和對照組差異不顯著，則是鹽酸多奈哌齊發揮了作用，推斷可能是這一藥物促使AchE活性降低。模型組和治療組的BchE活性均高于對照組，模型組和治療組的BchE活性無明顯差異，提示AD患者的BchE活性升高，而鹽酸多奈哌齊對于BchE活性，不會產生較為明顯的影響。乙酰膽堿是膽堿能系統中的主要遞質，在突觸處，如發生水解，會同時活化AchE、BchE，終止神經遞質功能。AchE活化后能夠促進Aβ沉積，且有研究證實〔8〕，AchE-Aβ復合物的神經毒性明顯大于單獨的Aβ肽，同時Aβ能夠升高AchE的活性。SOD是一種抗氧化金屬酶，能夠平衡體內的氧化與抗氧化，其含量能夠反映機體的抗氧化能力。MDA是膜脂過氧化最重要的一種產物，能夠加劇膜的損傷，因此可將其作為反映氧自由基水平的指標。本研究結果證實：AD可降低腦組織中SOD含量，升高Aβ表達量及MDA含量，而鹽酸多奈哌齊則能夠通過乙酰膽堿與Aβ之間的密切關系，有效降低腦內組織的Aβ表達量，進而減少腦內氧自由基的產生，降低MDA含量，升高SOD含量。此外，模型組的細胞凋亡比例明顯高于對照組及治療組，這一結果證實，鹽酸多奈哌齊可減少細胞凋亡比例，進而增加患者的逃避潛伏期。經空間探索實驗發現，對照組與治療組空間探索實驗結果均明顯低于模型組，可見AD模型組大鼠的空間記憶能力降低，對照組與治療組空間探索結果差異不明顯，說明鹽酸多奈哌齊能夠明顯改善大鼠的學習及空間記憶能力。目前主要將AD的學習、記憶障礙歸因于膽堿能神經遞質的缺乏。鹽酸多奈哌齊能夠降低AchE活性，使得乙酰膽堿濃度增加，進而改善其學習記憶功能。有研究顯示〔9〕，淀粉樣蛋白的產生與聚集是導致AD發病的中心環節，在發病早期，突觸的功能與結構受損主要是由于Aβ導致的，導致突觸的可塑性(多種學習形式的基礎)喪失，導致認知損害。突觸后致密區主要位于中樞神經系統的突觸后模，具有調節和聚合受體、穩定突觸結果的作用，而突觸后致密區蛋白95是突觸后致密區最為豐富的一種蛋白，與突觸后膜相隔12 nm，與多種離子通道受體、因子、蛋白等聯系密切，還能夠與其他許多胞質信號組成信號復合物，促進信號耦合，影響突觸傳遞及可塑性。本研究中，模型組大鼠腦內海馬CA1區、皮質突觸后致密區蛋白95表達明顯低于對照組和治療組，提示AD大鼠的突觸可塑性降低，而鹽酸多奈哌齊能夠提高突觸后致密區蛋白95表達水平，進而改善突觸的可塑性，改善認知功能。上述研究數據均證實，鹽酸多奈哌齊能夠通過多種方式，改善AD的癥狀，進而提高治療效果。