產氣莢膜梭菌實時熒光PCR和實時熒光RPA檢測方法的建立和比較

劉立兵，李睿文，陳志敏，王金鳳，孫曉霞，袁萬哲,*，王建昌,*

（1.石家莊海關，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗檢疫科學技術研究院，河北 石家莊 050051；3.河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071001）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），又稱為魏氏梭菌（Clostridiumwelchii），是一種革蘭氏陽性厭氧菌，也是一種人獸共患病病原體[1]。根據產氣莢膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四種主要毒素，可以將之分為A、B、C、D和E型[2-3]。不同型的產氣莢膜梭菌可以導致不同的疾病，均具有發病急、死亡率高等特點[4]。產氣莢膜梭菌廣泛分布在土壤、污水等自然環境中，引起的食物中毒事件在我國非常嚴重，攝入被產氣莢膜梭菌污染的食物后，能夠引起惡心、腹瀉等臨床癥狀，從而引發肌壞死性疾病[5]；羔羊、仔豬、牛犢、雛雞等動物感染產氣莢膜梭菌，會導致壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病[6]。產氣莢膜梭菌污染給人類健康和畜牧業健康發展造成了巨大的危害，因此對產氣莢膜梭菌的快速檢測對于疫病防控和食品安全保障具有重要意義。

目前，針對產氣莢膜梭菌的傳統檢測方法主要有分離培養、細胞素方法、卵磷脂水解實驗和反向間接乳凝膠結實驗等[7-9]，存在檢測周期長、技術要求高、過程繁瑣等不足。隨著分子生物學技術的發展，一系列針對產氣莢膜梭菌的新方法被建立并得到了廣泛應用。孫佳芝等[10]建立了靈敏度為4.57 μg/L的雙抗夾心酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法；鮑長磊[11]建立了產氣莢膜梭菌不同毒素型多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和α毒素抗體ELISA檢測方法；石玉玲等[12]根據16S rRNA基因建立了實時熒光PCR方法，靈敏度則為9h102CFU/mL；劉哲等[13]建立了特異性檢測產氣莢膜梭菌的環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，靈敏度為2.92h102CFU/mL。ELISA方法檢測靈敏度不高，試劑盒價格昂貴，且需要特異性設備；LAMP方法需要4～6 條引物，設計復雜，且極易造成假陽性結果[14]。因此，建立一種反應快速、操作簡便、靈敏性高的檢測方法對于產氣莢膜梭菌的有效控制依然具有重要意義。

聚合酶重組酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種等溫擴增技術，主要依賴于重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA聚合酶、單鏈結合蛋白3 種核心蛋白實現對靶基因的等溫擴增[15]。在反應過程中，重組酶結合引物形成蛋白-DNA混合物并啟動尋找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，則會引發鏈置換反應，引物結合到對應模板上，具有鏈置換功能的DNA聚合酶進而從引物3’末端開始啟動DNA合成，實現對靶基因的指數級擴增[9]。RPA能夠在37～42 ℃恒溫條件下20 min內完成對靶基因的有效擴增，特別適用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域，目前已經被廣泛應用于多種食源性致病菌的快速檢測[16-18]。

本研究根據編碼A～E型產氣莢膜梭菌α毒素的plc基因的高度保守區域，設計特異性引物和探針，建立實時熒光PCR和實時熒光RPA方法，并使用人工污染樣品對兩種方法進行驗證和比較，以期為食品中產氣莢膜梭菌的快速檢測提供有效技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌種見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

胰胨亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養基、0.1%蛋白胨水 北京陸橋技術股份有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq寶生物工程（大連）有限公司；TwistAmpTMexokit 英國TwistDx公司。

1.2 儀器與設備

7 5 0 0實時熒光P C R儀 美國A B I公司；Genie III等溫擴增熒光檢測系統 英國OptiGene公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

參考GenBank中登錄的產氣莢膜梭菌plc基因（登錄號：NC_008261.1），比對確定特異性保守序列，設計特異性引物和探針。所有引物探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列信息見表2。

表2 實驗所用引物及探針Table 2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCR

1.3.2 基因組DNA的提取

將產氣莢膜梭菌（ATCC 13124）接種到液體硫乙醇酸鹽培養基培養基中，37 ℃厭氧培養20 h。取純培養菌液1 mL，加入到1.5 mL離心管中，11 500 r/min離心1 min，收集沉淀。采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，使用NanoDrop 2000 C超微量分光光度計測定濃度，-20 ℃保存備用。

1.3.3 實時熒光RPA方法的建立

以1.3.2節制備的產氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物RPA-F/R和exo探針，使用TwistAmpTMexokit配制實時RPA反應體系（50 μL）：RPA-F/R（10 μmol/L）各2.1 μL，exo探針（10 μmol/L）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，將其混勻，加入到裝有凍干酶制劑的反應管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，蓋緊管蓋，瞬時離心并渦旋后，放入Genie III中，39 ℃反應20 min。在擴增過程實時收集檢測熒光信號，目的基因擴增后熒光信號會明顯增加。

1.3.4 實時熒光 PCR方法的建立

以1.3.2節制備的產氣莢膜梭菌DNA為模板，采用引物PCR-F/R和探針TaqMan Probe建立實時熒光PCR體系為（25 μL）：Premix ExTaq12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR-Probe（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，補水至25 μL。將上述體系充分振蕩混勻后，瞬時離心，放入7500實時熒光PCR儀中，反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，40 個循環，60 ℃收集熒光信號。

1.3.5 特異性和靈敏度實驗

以表1所示菌株DNA為模板，根據1.3.3節和1.3.4節建立的方法進行檢測，分析實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的特異性。

提取1 mL純培養產氣莢膜梭菌的基因組DNA，并測定其濃度，進行10 倍倍比稀釋，以不同稀釋度的基因組DNA作為模板，根據1.3.3節和1.3.4節建立的方法進行檢測，分析比較實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.6 對人工污染樣品的檢測比較

使用經GB 4789.13ü2012《食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》檢測確定不含產氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，分別取25 g加入到225 mL滅菌的0.1%蛋白胨水中，拍打均勻。取出9 mL樣品均液，加入一定濃度的產氣莢膜梭菌純培養液，使之濃度為1.0h106CFU/mL。拍打混勻，取1 mL人工污染產氣莢膜梭菌的樣品均液，用未污染產氣莢膜梭菌的樣品均液進行10 倍倍比稀釋，每個稀釋度分別取1 mL進行核酸提取，并以之作為模板分別通過實時熒光RPA和實時熒光PCR方法進行檢測。同時取各個稀釋的樣品菌液按照GB 4789.13ü2012方法進行平板計數，將3 種方法的檢測結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的特異性

通過建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法，分別以產氣莢膜梭菌基因組DNA和表1中的其他細菌基因組DNA為模板，進行特異性實驗分析。表3表明，兩種方法僅產氣莢膜梭菌有特異性擴增曲線，而其他菌株均無擴增曲線。上述結果表明建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法均具有良好的特異性。

表3 實時熒光RPA和實時熒光PCR方法特異性分析Table 3 Speci fi cities of real-time RPA and real-time PCR assays

2.2 實時熒光RPA和實時熒光PCR的靈敏度

圖1 產氣莢膜梭菌實時熒光RPA（A）和實時熒光PCR（B）方法的敏感性Fig. 1 Sensitivities of real-time RPA (A) and real-time PCR (B) for C. perfringens detection

測定所提取的產氣莢膜梭菌基因組D N A為1.3h105pg/μL，將其10 倍倍比稀釋至1.3h10-1pg/μL，分別進行實時熒光RPA和實時熒光PCR檢測。結果表明，實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的檢出限一致，均為1.3 pg/μL（圖1）。

2.3 人工污染樣品檢測結果

對于人工污染產氣莢膜梭菌的奶粉、雞肉、牛肉和羊肉樣品，每個稀釋度取1 mL模擬污染液，提取核酸，分別進行實時熒光RPA和實時熒光PCR方法檢測，與按照國家標準（GB 4789.13ü2012）的檢測進行對比分析。結果表明，實時熒光RPA和實時熒光PCR方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/mL，與標準GB 4789.13ü2012檢測方法的靈敏度一致（表4）。實時熒光RPA能夠在20 min內完成檢測，僅需要3～13 min即可實現對所有陽性樣品的檢測，而實時熒光PCR完成整個反應則需要55 min左右，需要24～46 min（Ct值為17.45～33.65）實現對陽性樣品的檢測。實時熒光RPA方法在陽性樣品的確認時間上明顯優于實時熒光PCR方法，而在標準檢測中，需要在36 ℃進行20～24 h的增菌，在檢測時間方面較前兩種方法更長。

表4 人工污染樣品檢測結果Table 4 Results of detection of artificially contaminated samples

3 討 論

食源性致病菌是影響食品安全的重要因素之一。由產氣莢膜梭菌引起的食物中毒報道事件逐年上升，對人類的健康造成了嚴重影響。建立一種快速、特異、精準的產氣莢膜梭菌檢測方法，對人類的健康和畜牧業的發展有重要意義。本研究采用實時熒光RPA技術檢測產氣莢膜梭菌。實時熒光RPA反應是基于RPA反應體系中加入exo探針，擴增過程中產生的熒光信號通過熒光檢測儀實現實時檢測，作為一種等溫擴增技術，它具有特異性強、靈敏性高、反應快速等優點，在細菌檢測方面、病毒檢測等方面應用廣泛[19-23]。實時熒光PCR是PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程，通過標準曲線對未知模板進行分析的技術，該技術以其特異性強、靈敏度高等優點，在食源性致病菌檢測[12,24-25]、轉基因產品檢測[26]，以及致病性鉤端螺旋體[27]和兔熱病桿菌檢測[28]中都得到廣泛的應用。

plc基因編碼的α毒素是產氣莢膜梭菌的主要外毒素，存在于A～E型產氣莢膜梭菌中，是導致畜禽壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽等疾病的主要致死因素，其毒性最強，是國內外研究產氣莢膜梭菌最多的毒素[29-30]。本研究根據plc基因設計特異性的引物和探針，建立的實時熒光RPA和實時熒光PCR方法對產氣莢膜梭菌具有很好的特異性，不同類型的標準株和分離株均得到了特異性擴增。對于人工污染樣品，兩種方法的最低檢出限均為1.0h102CFU/g，但實時熒光RPA方法的檢測時間（20 min）明顯少于實時熒光PCR方法（55 min），極大地縮短了實際樣品的檢測周期，更適合于實際樣品的快速檢測。

本研究使用Genie III實時熒光RPA運行設備，大小為25 cmh16.5 cmh8.5 cm，質量僅為1.75 kg左右，具有體積小、便攜式的特點，而且適用鋰電池充電工作，可以維持設備24 h的運行，非常適合實驗設備相對落后的基層檢測部門，以及食源性疫情的現場檢測，為產氣莢膜梭菌的快速現場診斷提供了有效的技術手段。