基于三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法篩查和確證水產(chǎn)品中多種抗生素殘留

孟 勇，王 靜，朱曉華，耿雪冰，楊 總，沈美芳,*

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京），江蘇 南京 210017；3. SCIEX亞太應(yīng)用中心，上海 201206）

近年來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的多元化，養(yǎng)殖規(guī)模的集約化，再加上品質(zhì)、種質(zhì)以及漁業(yè)環(huán)境惡化等因素的影響，致使各種水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生率日趨嚴(yán)重，因此為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中疫病的發(fā)生，藥物的使用已變成常規(guī)的養(yǎng)殖輔助手段。目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的抗菌藥物有喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等，都是廣譜抗菌藥，幾乎對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、某些支原體和衣原體等都具有較強的抑菌作用[1-3]。但由于水產(chǎn)養(yǎng)殖的特殊性及缺乏相應(yīng)的科學(xué)指導(dǎo)，養(yǎng)殖業(yè)者在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中為保證藥效常常超量或者違規(guī)使用藥物，藥物品種越來越復(fù)雜，對水產(chǎn)品中藥物殘留篩查和確診技術(shù)的要求也越來越高。

目前，國內(nèi)外對水產(chǎn)品中抗生素殘留的研究日趨重視，檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4-6]、液相色譜法[7-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]、高分辨質(zhì)譜等[14-15]。酶聯(lián)免疫法具有操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點，但定量不夠準(zhǔn)確，容易出現(xiàn)假陽性。液相色譜法具有分析效率高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，由于抗生素藥物種類繁多和樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，其在多種藥物的同時篩查和藥物的定性方面具有一定的局限性。高分辨質(zhì)譜因為其質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確，定性能力強，但該儀器定量能力弱，價格相對昂貴，普及率較低。本研究應(yīng)用液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)，采用分段時間多反應(yīng)監(jiān)測、信息關(guān)聯(lián)采集、增強子離子掃描、譜庫檢索的檢測模式[16-18]。其原理是根據(jù)各個化合物的保留時間，在其設(shè)定的時間窗口內(nèi)，當(dāng)多反應(yīng)監(jiān)測信號超過設(shè)定的閾值時，多反應(yīng)監(jiān)測和增強子離子掃描會同時觸發(fā)，得到該化合物的二級質(zhì)譜碎片的全譜信息。并且實現(xiàn)了在優(yōu)于常規(guī)三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀利用2 對子離子的采集信息進行定性定量的基礎(chǔ)上，結(jié)合建立的增強子離子掃描譜庫對比功能，對可疑色譜峰通過二級譜庫檢索進一步確證。目前水產(chǎn)品中藥物殘留的篩查和確證方法主要還是利用高分辨質(zhì)譜檢測技術(shù)[19-21]，但是基于三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法針對水產(chǎn)品殘留確證技術(shù)的報道很少[22]。因此，本方法擬實現(xiàn)同時對水產(chǎn)品中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等多種抗生素殘留進行快速篩查和確證，為保障我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全和風(fēng)險監(jiān)測提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、甲酸、乙酸（均為色譜純） 美國ROE公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；土霉素、金霉素、四環(huán)素、氘代恩諾沙星、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代土霉素標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；喹諾酮類（16 種）和磺胺類（19 種）標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度為100 mg/L，純度均大于98.3%） 天津阿爾塔科技有限公司；實驗用水為Millipore系統(tǒng)超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國SCIEX公司；T18勻漿機 德國IKA公司；AllegraTM離心機美國Beckman公司；Turbo Vap濃縮工作站 瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

粉末狀標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。從質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液中各取100 μL，用甲醇定容至10 mL，制備質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩嶒炛性儆?.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液作為溶劑，逐級稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液待用。

氘代恩諾沙星、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代土霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別用1.0%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液。從上述質(zhì)量濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液中各取100 μL，用0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液作為溶劑，制備質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.0 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入1.0 mg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混合30 s，避光放置5 min。再加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶液和0.1 g乙二胺四乙酸二鈉，渦旋振蕩1 min，超聲提取3 min，8 000 r/m離心5 min，取上清液。殘渣中加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶液，并用玻璃棒搗碎，重復(fù)提取1 次，合并2 次提取液，搖勻備用。提取液于40 ℃氮氣條件下吹干，殘渣用1 mL的0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液溶解，渦旋振蕩30 s，加入2 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min離心5 min，移取下層溶液于1.5 mL高速離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜后上機測定。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

表1 多種抗生素和3 種內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for multiple antibiotics and three internal standards

Agilent Poroshell EC-C18色譜柱（100 mmh2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，97% A；1～2 min，97%～85% A；2～9 min，85%～75% A；9～15 min，75%～45%A；15～16 min，45%～97% A；16～20 min，97% A。電噴霧離子源正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強離子掃描檢測模式；離子化電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；氣簾氣壓力0.21 MPa；霧化氣壓力0.41 MPa；輔助加熱氣壓力0.41 MPa。具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SigmaPlot 11.0處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

目前磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類藥物的提取劑主要有：乙腈[23]溶液、三氯乙酸溶液[24]、甲醇溶液[25]、磷酸鹽緩沖液[26]等。本實驗考察提取溶劑種類、提取方式、提取用量等因素對提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取劑具有較好提取效果和去蛋白特性，也更有利于后續(xù)的凈化處理，優(yōu)于其他提取劑。質(zhì)譜檢測時采用正離子模式，因此加入適當(dāng)?shù)乃嵝匀芤河兄谔崛》治鑫锏碾婋x和提取，但四環(huán)素類藥物的回收率偏低，不足40%。參考相關(guān)文獻[12]，使用1%甲酸-乙腈溶液作為提取液，加入0.1 g乙二胺四乙酸二鈉，四環(huán)素類化合物的回收率明顯增加，其他化合物的回收率在70%～110%之間，從而保證了所有分析目標(biāo)物的提取效率。

樣品凈化主要方式有液液萃取[11]、QuEChERS[14]、固相萃取[13,26]、分散固相萃取[27]等。本實驗加入了QuEChERS常用的無水NaSO4或無水MgSO4等凈化劑，可能是因為化合物的水溶性或者產(chǎn)生的放熱反應(yīng)，對部分抗生素特別是喹諾酮類和四環(huán)素類化合物的回收率有較大影響。喹諾酮和磺胺類藥物結(jié)構(gòu)中含有羧基、堿性氮原子或氨基，顯示出酸堿兩性。HLB固相萃取柱是親水-親脂平衡型柱，對極性和非極性化合物均有很好的保留，在獸藥殘留檢測中得到廣泛應(yīng)用[29]，但固相萃取操作過程較為繁瑣、耗時長、成本較高，批次間實驗結(jié)果重復(fù)性較差。因為本方法的儀器檢測條件對分析目標(biāo)物具有很高的特異性選擇，檢測圖譜中較少雜質(zhì)峰干擾，正己烷去脂能夠滿足檢測要求，從而降低了檢測成本，縮短了前處理時間。

2.2 色譜條件優(yōu)化

比較Cortecs C18（100 mmh3.0 mm，2.7 μm）、Kinetex C18（100 mmh2.1 mm，2.6 μm）和Agilent Poroshell EC-C18（100 mmh2.1 mm，2.7 μm）3 種色譜柱分離多種抗生素的分離效果。結(jié)果表明，3 種色譜柱均能將38 種抗生素化合物分離，但Cortecs C18各色譜峰出峰時間較長，最遲出峰的氟甲喹峰形拖尾較為嚴(yán)重，四環(huán)素類抗生素在Agilent Poroshell EC-C18色譜柱的響應(yīng)值相對更高，各分析目標(biāo)物分離效率高，穩(wěn)定性好，色譜峰形優(yōu)異。

分別比較甲醇和乙腈作為本實驗流動相的有機相對各分析目標(biāo)物的分離效果影響。結(jié)果表明甲醇作為流動相時，離子化效率要優(yōu)于乙腈，相應(yīng)值更高，但乙腈的基線噪音要優(yōu)于甲醇，分析目標(biāo)物的靈敏度相對更高。因此，相較而言本實驗選擇乙腈作為強洗脫流動相。

本實驗分別選取水-乙腈、0.1%甲酸-乙腈溶液、含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨-乙腈溶液、含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液作為流動相，比較不同流動相體系的洗脫效果。結(jié)果表明甲酸能夠增加各種化合物在電噴霧離子源正離子模式下的離子化效率，峰形對稱尖銳；乙酸銨雖然能夠增加部分化合物的離子化效率，但是峰形變寬，質(zhì)譜圖中部分色譜峰會出現(xiàn)毛刺；甲酸銨會造成部分化合物分離效果不佳，后出峰的化合物拖尾嚴(yán)重，保留時間延長。故選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在正離子模式下，38 種抗生素及3 種內(nèi)標(biāo)均可獲得較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰[29]。本實驗分別通過對各化合物碰撞選擇離子、碰撞能量和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后豐度較高的2 個子離子作為定量和定性離子，最終選擇確定的掃描時間窗口、母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)（表1）。磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺鄰二甲氧嘧啶作為同分異構(gòu)體，在本實驗的檢測條件下能夠完全相互分離，保留時間分別為9.96 min和6.89 min。按優(yōu)化條件進行測定，見圖1。

圖1 質(zhì)量濃度均為20 μg/L的38 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram for a mixed standard solution of the 38 antibiotics (20 μg/L) in MRM mode

王志杰等[11]研究33 種喹諾酮和磺胺類藥物殘留檢測以及郭萌萌等[12]研究的23 種漁藥殘留檢測等漁藥多殘留分析液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，均采用常規(guī)的多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，因為監(jiān)測的化合物較多，為保證每個化合物色譜峰采集的點數(shù)足夠，分配的駐留時間設(shè)定非常小。通常情況下，每個色譜峰需要采集12 個點，才能使其具有良好的峰形和重復(fù)性，駐留時間對化合物的峰形影響很大[30]。在實際檢測過程中存在水產(chǎn)品各種復(fù)雜基質(zhì)的干擾，由于駐留時間很短，往往很難保證化合物能夠采集足夠的點數(shù)，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確定性和定量。因此，本實驗采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子及分段時間掃描模式，利用每種化合物保留時間分別確定每個化合物的掃描窗口，在設(shè)定的掃描窗口只監(jiān)測該化合物的定性、定量離子，從而保證每個化合物所分配的掃描窗口得到足夠駐留時間。同時當(dāng)多反應(yīng)監(jiān)測信號超過設(shè)定的閾值時，Q3會自動切換為線性離子阱，并對該多反應(yīng)監(jiān)測通道執(zhí)行增強子離子，獲得二級質(zhì)譜圖，從而對多反應(yīng)監(jiān)測的檢測判定予以補充。

2.4 化合物譜庫的建立及檢索

常規(guī)的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜只能得到多反應(yīng)監(jiān)測的2 對離子的色譜峰，定性和定量僅靠兩對離子的豐度比確定。本實驗采用三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀，并采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描模式，在多反應(yīng)監(jiān)測的基礎(chǔ)上還可以采集增強型二級質(zhì)譜圖。另外，該譜庫是開放性的，可以在原有譜庫的基礎(chǔ)上，采集高、中、低（50、40、30 eV）3 種碰撞能量下添加標(biāo)樣后的實際樣品二級質(zhì)譜圖，從而對樣品基質(zhì)條件下的增強子離子圖進行補充，提高匹配率。本方法實現(xiàn)了一次進樣，可以同時得到多反應(yīng)監(jiān)測的色譜圖和高靈敏度的增強子離子圖，并能夠通過保留時間、定量離子、輔助定性離子及二級質(zhì)譜譜庫的增強子離子譜庫比對進行定性、定量分析，相較于常規(guī)三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測，可有效降低假陽性或假陰性樣品結(jié)果。

2.5 方法學(xué)驗證

取質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.3節(jié)方法上機測定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)，定量離子和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)離子峰面積的比值y為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示，恩諾沙星等16 種喹諾酮類化合物的線性范圍為1.0～200.0 μg/L；磺胺嘧啶等19 種磺胺類化合物的線性范圍為1.0～200.0 μg/L；四環(huán)素等3 種四環(huán)素類化合物的線性范圍為2.0～200.0 μg/L，所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3 倍信噪比確定化合物的檢出限。選用陰性草魚作為空白基質(zhì)，分別添加3 個質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品，其中最低添加量為方法定量限，每個水平做6 個平行樣品，按照1.3.2節(jié)進行樣品前處理、以1.3.3節(jié)測定條件進行檢測，結(jié)果見表2。結(jié)果表明38 種抗生素在3 個不同添加水平的平均回收率為63.5%～117.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～14.8%，檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量限為1.0～5.0 μg/kg。

表2 多種抗生素的檢出限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Limits of detection, recoveries and relative standard deviations of multiple antibiotics (n= 6)

2.6 實際水產(chǎn)品中38 種抗生素殘留的分析檢測結(jié)果

將該方法用于池塘和湖泊養(yǎng)殖河蟹、草魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚、鱸魚、鰱魚、斑點叉尾鮰、烏鱧、鱖魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦等13 個品種289 個樣品中抗生素的快速篩查分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10 個草魚、8 個鯉魚、7 個鯽魚、5 個鱸魚、2 個烏鱧、2 個克氏原螯蝦、2 個斑點叉尾鮰共36 個樣品篩查出含有恩諾沙星殘留；3 個鱸魚、2 個草魚、2 個鯽魚、1 個烏鱧共8 個樣品篩查出含有環(huán)丙沙星殘留；1 個鯽魚、1 個鳊魚篩查出含有氧氟沙星殘留，1 個鯽魚篩查出含有磺胺間甲氧嘧啶殘留；2 個鳊魚分別篩查出含有磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶。

以上結(jié)果中有2 個喹諾酮類陽性可疑樣品，通過查看未知化合物增強型二級全掃譜圖，并與譜庫中的二級全掃譜庫進行匹配，結(jié)果見圖2、表3。可疑的草魚樣品中恩諾沙星正向匹配率為88.91%，反相匹配率為89.23%，平均匹配率為84.72%。另一個可疑克氏原螯蝦樣品中恩諾沙星正向匹配率為90.0%，反相匹配率為45.1%，平均匹配率為40.3%。分析原因是克氏原螯蝦的基質(zhì)成分和譜庫中的基質(zhì)成分有所差異，造成了反相匹配率較低，因此通過在克氏原螯蝦空白樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，采集其相關(guān)數(shù)據(jù)添加到譜庫后重新進行匹配，反相匹配率提高為89.7%，平均匹配率為85.1%。

圖2 陽性可疑樣品的增強子離子掃描譜圖（A）與譜庫中的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)譜圖（B）的對比Fig. 2 Comparison of EPI spectrum of a doubtful positive sample (A)and the library spectrum of enrof l oxacin (B)

表3 陽性可疑樣品的增強子離子掃描與譜庫匹配及低匹配度篩選結(jié)果Table 3 Results of searching for EPI chromatogram of a doubtful positive sample in the library

3 結(jié) 論

本實驗采用三重四極桿復(fù)合線性離子肼質(zhì)譜法建立水產(chǎn)品中38 種抗生素的篩查與鑒定方法，結(jié)合實驗室自建的二級全掃譜庫可對陽性可疑樣品進行鑒定。通過分段時間多反應(yīng)監(jiān)測-信息關(guān)聯(lián)采集-增強子離子掃描的檢測模式，一次進樣即可同時得到多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖和高靈敏度的二級碎片質(zhì)譜圖，通過譜庫檢索排除假陽性或假陰性結(jié)果，相較于常規(guī)的漁藥多殘留液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀采用多反應(yīng)監(jiān)測檢測技術(shù)，更加具有優(yōu)勢。綜上所述，該方法分析速度快、靈敏度高、篩查范圍廣，適用于水產(chǎn)品中抗生素殘留的篩查與鑒定，為滿足實驗室進行日常檢驗和風(fēng)險監(jiān)測提供了一種有力的技術(shù)手段。