不同品牌洗發水對蠶豆根尖細胞遺傳毒性探究

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一、前言

中國是世界上洗發水產量和銷量最大的國家，洗發水主要是以表面活性劑為主體復配而成的、具有清潔人的頭發和頭皮、并保持其美觀作用的產品，是廣大群眾日常生活使用量很大的日化產品。洗發水的組分包括表面活性劑、穩定劑、功能性添加劑，防腐劑和香精等[1]，輕工行業標準“QB/T1974-2004洗發液”[2]定義洗發水的有效物為總固體減去無機鹽和氯化物的量，其多少決定了產品的清潔效果。洗發水主要有效物一般是陰離子表面活性劑，合適的表面活性劑能達到泡沫豐富、低刺激、洗凈度高但脫脂力弱的效果。

微核(micronucleus,簡稱MCN)是染色體畸變類型之一，往往是細胞經輻射或化學藥物作用，由有絲分裂后期散失著絲粒的染色體片斷產生的[3]，其染色體與細胞核相似，比主核小，故稱微核。

微核測定技術是一種遺傳毒理方面的短期致突變試驗方法，可用于化合物致突變性檢測、環境污染監測、新藥試驗及癌癥前期診斷等方面。微核試驗(micronucleus Test)方法具有敏感度高、快速、經濟、不需要精尖設備和深湛技術的優點[4]。近年來，隨著分子生物學技術的發展，微核試驗已發展成為可檢測染色體斷裂、染色體丟失、染色體不分離、細胞分裂延遲和凋亡等多個終點的細胞分子毒理學檢測方法.

蠶豆(Vicia faba)是經典的遺傳學研究材料[5],蠶豆染色體大，數量少(2n=12)，根尖中含有較多的分裂相細胞，非常適合顯微鏡觀察，而且蠶豆根尖細胞周期中的大部分時間對誘變劑敏感，便于遺傳毒性檢測實驗.

本實驗選用四種品牌的洗發水，根據人們的日常用量，分別取五個不同濃度，進行蠶豆根尖的染毒實驗，探究不同品牌洗發水在不同濃度時對蠶豆根尖細胞微核率的影響，探究洗發水對植物根尖細胞的遺傳毒性。

二、實驗

(一)實驗材料

潘婷、海飛絲、飄柔、歐萊雅四種不同品牌的洗發水；青皮松滋蠶豆；

(二)實驗試劑

①1mol/L HCl

②45%醋酸

③70%乙醇。

④卡諾氏液：無水乙醇(或95%乙醇)3份加冰醋酸1份配成,固定根尖時隨用隨配。

⑤夫氏(Schiff)試劑：稱1 g堿性品紅緩慢的加入到煮沸的250 mL蒸餾水中煮沸到200 mL。待其冷卻到50-55℃時加入20 mL 1 mol·L-1的 HCl，過濾于深棕色試劑瓶中，待濾液瓶冷至25℃時再加1 g偏重亞硫酸鉀(K2S2O5)充分振蕩使其溶解。塞緊瓶口，用黑紙包好，置于4℃的冰箱中，24小時后檢查如透明無色即可使用。此染色液在可保存6個月左右，若出現沉淀就不能再用。

⑥SO2洗滌液：

貯存液：(1)10% Na2S2O5溶液

(2)1 mol·L-1HCl

使用液：現用現配，取上述10% Na2S2O5(或10% K2S2O5)溶液5mL，加1mol/L HCl 5mL，再加蒸餾水100mL配成。

(三)實驗步驟

1.浸種

選取大小一致顆青皮松滋蠶豆放入盛有25℃蒸餾水的燒杯中，液面略高于蠶豆種子，置25℃的恒溫箱內，浸泡26-30h，期間每隔6-8h換一次水，換用的蒸餾水預先置25℃恒溫箱中預熱。

2.催芽

將棉紗布折疊3-4層平鋪在培養皿內，加入過量25℃蒸餾水使之完全浸濕并有適量浸出，將蠶豆放入培養皿，使出芽口浸入水中，再蓋上濾紙放入恒溫箱中，在25℃下催芽，并適時觀察補充水分，確保培養環境濕潤，催芽時間約20h。

當初生根露出2-3ml時，選取發芽狀況良好的63顆種子繼續放入培養皿中催芽，使大部分的初生根長至2-3ml。

3.被檢測液處理根尖

將配制好的四種品牌的五種不同濃度的洗發水溶液分別裝入洗凈的青霉素瓶中，每種濃度做兩個樣，每種品牌洗發水溶液裝15瓶，將催好芽的蠶豆單個放在青霉素瓶口，并使蠶豆芽根部浸入溶液中，用同樣方法在三個青霉素瓶中放入蒸餾水，處理蠶豆作為空白對照組。將青霉素瓶放入25℃恒溫箱中染毒處理6h。

4.根尖細胞恢復處理

(1)將處理后的種子，用或蒸餾水浸泡3次，每次2—3h。

(2)種子再放在盛有蒸餾水的青霉素瓶上，使根浸入水面下，放入25℃恒溫箱中使根尖細胞恢復22-24h。

5.固定根尖細胞

(1)將恢復后的種子，從根尖頂端切下1cm長的幼根放入青霉素空瓶中，加卡諾氏固定液固定24h。

(2)將固定后的幼根，換入盛有70%乙醇的青霉素中，置 4℃的冰箱內保存備用。

6.孚爾根(Feulgen)染色

(1)定好的根尖在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗兩次，每次5min。

(2)吸凈蒸餾水，再加入1mol/L HCl將幼根泡住，連瓶放入60℃恒溫水浴鍋中水解幼根10-20min，至幼根軟化。

(3)用蒸餾水浸洗幼根2次，每次5min。

(4)在遮光條件下加席夫(Schiff)試劑，染色1h，每瓶用量以掩住幼根液面高出2mm為宜。

(5)除去染色，用SO2洗液浸洗幼根2次，每次5min。

(6)用蒸餾水浸洗1次，5min。

(7)將幼根放入新換的蒸餾水中，置4℃的冰箱內保存，供隨時制片使用。

7.制片

(1)幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截下1mm左右的根尖。

(2)滴上少許45%的醋酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。

(3)加蓋一清潔的蓋玻片，注意不要有氣泡。

(4)再在蓋玻片上加一小塊濾紙，用竹簽輕輕敲打壓片。

8.鏡檢及微核識別標準

將制片先置顯微鏡低倍鏡下，找到分生組織區細胞分散均勻、膨大、分裂相對較多的部位，再轉到高倍鏡(物鏡40×)下進行觀察。

(1)凡是主核大小的1/3—1/20，并與主核分離的小核。

(2)小核著色與主核相當或稍淺。

(3)核形態可以是圓形、橢圓形、不規則形。

每一種處理觀察3個根尖，每個根尖計數1000個細胞中的微核數。

9.數據的計算

將觀察得到的有關微核數據，根據如下步驟進行統計處理：

(1)微核千分率(MCN‰)的計算：

參考標準:MCN‰在10‰以下為基本無污染；

MCN‰在10‰—18‰區間為輕污染；

MCN‰在18‰—30‰區間為中污染；

MCN‰在30‰以上為重污染。

三、實驗結果及分析

利用顯微鏡觀察到蠶豆根尖細胞情況，圖1是部分觀察到微核的蠶豆根尖細胞圖例，箭頭所標記即為微核：

圖1 圖2

圖3 圖4

(一)染毒6小時微核千分率與顯著性分析

對照組鏡檢時得出的蠶豆根尖微核數據如下：

序號細胞數微核數微核千分率(‰)平均微核率(‰)x±s1#2#3#1000100010006556555.33±0.58

數據說明蒸餾水處理下能出現少量的微核率，但誘導現象不明顯，不能產生顯著的毒理效應。

將經過6小時染毒處理的蠶豆根尖微核檢出數據列表如表,并計算出各樣品微核千分率，算出各品牌樣品的各個濃度的平均微核率，用spss軟件進行顯著性分析，經樣品溶液染毒6小時后，各蠶豆根尖的微核檢出率相對于蒸餾水處理的微核千分率明顯增高。且各溶液的微核率都隨著溶液濃度的增加而呈現上升的劑量-效應關系的趨勢.從數據中還可以明顯看出，同濃度下飄柔溶液染毒的蠶豆根尖微核率明顯比其他品牌溶液處理的高，說明洗發水對蠶豆根尖細胞具有遺傳毒性效應，且本文中飄柔品牌誘變效應相對較強，洗發水作為一種有機污染物，無論是在人們日常使用過程的直接接觸中，還是通過排入到河流湖泊等通過水中生物對人體產生的間接影響，都能對人體健康產生潛在危險性，所以在使用過程中應引起高度關注。

(二)蠶豆根尖細胞微核率與各處理濃度關系分析

將經各檢測液處理6小時的蠶豆根尖以平均微核率為縱坐標，濃度為橫坐標，將各品牌溶液染毒的數據圖繪制如下：

圖2 蠶豆根尖平均微核率與處理濃度關系圖

由圖2可以看出，經檢測液處理6小時的根尖平均微核率均呈現隨濃度升高而增加的劑量-效應關系，微核是染色體畸變后變現出的一種損傷類型，各種類型染色體畸變是產生微核的主要途徑，所以染色體畸變率與微核率具有一定的相關性，由此可以推測洗發水中存在某種能導致蠶豆根尖細胞發生突變的物質，由圖也可以看出，飄柔的誘變能力最強，海飛絲跟歐萊雅在低濃度時誘變差異性大，但隨著濃度的不斷加大，它們的誘變能力趨于一致，而潘婷的誘變能力相比而言，是四者中最低的。

(三)污染指數處理分析

“污染指數”判別可避免因實驗條件等因素帶來的MCN‰本底的波動，其計算方法如下：

標準：污染指數在0—1.5區間為基本沒有污染；

污染指數在1.5—2區間為輕污染；

污染指數在2—3.5區間為中污染；

污染指數在3.5以上為重污染。

凡數值在上、下限值時，定為上一級污染。

將各樣品處理的蠶豆根尖細胞平均微核率數據列表如表2，根據污染指數計算方法進行數據處理。依次計算出各濃度各樣品的污染指數，并結合污染程度列表如下：

表2 蠶豆根尖經各樣品染毒后污染指數與污染程度

將經各檢測液處理6小時后的蠶豆根尖細胞以污染指數為縱坐標，濃度為橫坐標做圖比較如下：

圖3 蠶豆根尖細胞經處理污染指數與時間關系圖

由表5可以看出，所有樣品的污染指數范圍為0.6—5.5。處理6小時的樣品均受到了一定程度的污染，且飄柔在濃度較低時就能引起較大的污染，歐萊雅引起的污染波動程度不是很大。潘婷跟海飛絲變化的較為明顯，從沒有受到污染變化到重污染，波動范圍大，差異性顯著。

四、討論

蠶豆根尖微核及染色體畸變試驗技術近年來逐漸應用于監測環境污染，進行遺傳毒理學研究或篩選誘變劑工作[6]，陶少武認為,根尖長度對蠶豆微核試驗存在正相關關系,因此在應用微核技術時,應嚴格篩選材料,盡可能保持初生根長度的一致[7]。

從各品牌溶液微核檢出率分析，經洗發水溶液染毒的微核率明顯高于用蒸餾水做對照處理的對照組，表明蠶豆根尖在洗發水的誘變下能誘發出較為明顯的微核，由此可知，洗發水中存在著某種能使蠶豆根尖細胞產生突變的物質，此外，從各品牌的不同濃度溶液處理后的蠶豆根尖微核檢出率分析可以得知，隨著濃度的增高，各濃度處理后的蠶豆根尖微核率呈現明顯上升的趨勢。

從蠶豆根尖細胞微核率與各處理濃度關系的分析圖可以看出，飄柔品牌的平均微核率無論在那個濃度都是比其他三個品牌的高，且上升趨勢較為平穩。同時還可以看出，海飛絲品牌的上升趨勢增長的最快，在不同濃度的微核率波動變化最大，表明不同濃度的微核率存在顯著差異，歐萊雅品牌在濃度0.20%之前有一個從上升到下降的變化過程，理論上應該是緩慢上升的，但出現這種結果原因可能是由于鏡檢過程中，找的計數視野偏離了分生區，從而數得的微核率比正常低，所以導致結果有了一個下降的趨勢，潘婷品牌隨著濃度的升高微核率也是呈現上升的趨勢，但上升的較為緩慢，比較可知，在四種品牌中，潘婷的致蠶豆根尖細胞突變率最低，有關研究指出，蠶豆與小鼠在分類上屬于同一個層次，蠶豆染色體的損傷可以在一定程度上反映同樣暴露條件下哺乳動物遺傳物質的損傷[8，9]，也就是對人體的危害最小，飄柔的致蠶豆根尖細胞突變率最大，對人體的健康影響危害最大。

由蠶豆根尖經各樣品染毒后污染指數與污染程度的表格數據明顯可以看出，飄柔品牌在濃度0.05%-1.00%是從沒有污染到重污染，變化明顯；海飛絲品牌也是從沒有污染到重污染，同樣變化明顯；飄柔品牌是從中度污染到重污染，說明在溶液濃度較低時，就已經對微核細胞突變率產生了較大影響，即在濃度較低時，就可以對人體產生較大影響；歐萊雅品牌是從輕污染到重污染，說明在溶液濃度較低時，對細胞突變產生了較小的影響，所以人們在使用此種品牌的洗發水時，對用量應該有一定的控制。

由不同品牌的不同濃度與污染指數柱形圖可以看出，在濃度為0.05%時，飄柔的污染指數最大，其次是歐萊雅，潘婷跟海飛絲在濃度較低時，污染指數較小；在濃度為0.10%時，飄柔和海飛絲的污染指數基本相同，其次是潘婷，海飛絲污染指數增加不明顯；在濃度為0.25%時，污染指數最大的依舊是飄柔，此時，海飛絲的污染指數有了一個較大的增長，歐萊雅出現了不顯著的下降，可能是鏡檢過程出現的誤差，潘婷依舊是略微的增長；在濃度為0.50%時，各品牌都呈現了平穩的上升趨勢；在濃度為1.00%時，各品牌都呈現顯著的增長趨勢；總之，隨著濃度的不斷上升，污染指數的增加趨勢越來越明顯。

四種品牌的洗發水致微核率強度比較為：飄柔>歐萊雅>海飛絲>潘婷；其中在濃度較低時潘婷和海飛絲為基本沒有污染，飄柔為中度污染，可知潘婷和海飛絲致突變率較低，對人體的健康危害影響最小，飄柔的致蠶豆根尖細胞突變率最大，對人體健康的危害最大，人們在使用時要特別注意使用量。由參閱的大量文獻可知，此研究結論與其他研究報道[10][11]相符。

五、結論

(1)蠶豆根尖經蒸餾水對照處理后能產生一定的微核率，但是不明顯，對比之下，經洗發水溶液處理后，蠶豆根尖細胞的微核率有很明顯的升高，這即說明了洗發水溶液中存在著某種能誘發蠶豆根尖細胞突變的物質。

(2)同一品牌在不同濃度下，濃度范圍為0.05%-1.00%時，對蠶豆根尖細胞微核率產生的影響不一樣，由實驗數據可知，隨著濃度的不斷升高，越高的溶液濃度對蠶豆根尖微核率產生的影響越大，即濃度跟微核率呈正相關。

(3)以四種品牌在不同濃度下染毒6小時的微核率數據分析，比較分析總體的數據升降趨勢得四種品牌的微核率強度比較為：飄柔(C>歐萊雅(D)>海飛絲(B)>潘婷(A)，由此可以看出，飄柔品牌的致突變率最大，潘婷的致突變率最低。

(4)在染毒6小時的情況下，在濃度為0.10%以下時，海飛絲品牌和潘婷品牌是基本無污染的，說明在此濃度下使用在兩種品牌的洗發水，對人體健康是基本無影響的，在0.05%濃度時，歐萊雅是輕污染，說明在使用該種品牌洗發水時，要特別注意使用量，在低濃度下才能保證對人體健康基本無害。