shRNA-SIVA1慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響

王曉通 吳錕 李雷 麥威 鐘曉剛

1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外周血管外科（南寧530021），2廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院胃腸肝膽外科（南寧 530001）

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在我國(guó)惡性腫瘤中分別居第二、三位［1］。化療在中晚期胃癌和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移型胃癌的治療中發(fā)揮重要的作用。然而有研究表明，增加化療并不能延長(zhǎng)胃癌患者的生存期［2］。其中一個(gè)重要的原因是腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。因此，尋找調(diào)節(jié)和對(duì)抗胃癌耐藥性的方法、揭示胃癌耐藥性的分子機(jī)制具有重要意義。

SIVA1基因作為促凋亡分子，能通過與CD27結(jié)合誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡［3］。研究表明SIVA1能夠通過與多種受體結(jié)合，增加乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［4-5］，但目前關(guān)于SIVA1在胃癌耐藥中的作用尚未有報(bào)道。為了探討SIVA1在胃癌耐藥發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過構(gòu)建靶向人SIVA1基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP，探討沉默SIVA1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞耐藥性以及細(xì)胞增殖的影響，并通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xL的蛋白表達(dá)，探討SIVA1影響胃癌耐藥的可能機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP由本實(shí)驗(yàn)室自行誘導(dǎo)構(gòu)建并保存。目的質(zhì)粒載體GV493、輔助載體 pHelper1.0、pHelper2.0、限制性內(nèi)切酶（AgeI、EcoRI）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。RNAi靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)和合成、陽性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序、對(duì)GV493慢病毒載體的改造和病毒包裝由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司完成。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；順鉑（DDP）購(gòu)自山東齊魯制藥公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher公司，qRT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ購(gòu)于Takara公司，PCR引物由Takara公司設(shè)計(jì)并合成；Western細(xì)胞裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天公司；TRIzol、PVDF膜購(gòu)自Invitrogen公司；SIVA1、Bcl-2、Bcl-xL、GAPDH的兔抗人單克隆抗體購(gòu)自CST公司；CCK-8購(gòu)于日本同仁公司。

1.2 shRNA-SIVA1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 shRNA-SIVA1質(zhì)粒載體構(gòu)建 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找SIVA1基因（NM_006427）序列，設(shè)計(jì)3條SIVA1靶點(diǎn)干擾序列并以通用陰性對(duì)照序列作為靶序列的陰性對(duì)照（negative control，NC）。相關(guān)序列見表1。

表1 靶向SIVA1基因的三條shRNA序列和陰性對(duì)照序列Tab.1 Three shRNA sequences and negative control sequences targeting siva1 gene

限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRI雙酶切獲得線性化的GV493載體，引物退火形成雙鏈DNA，線性化的GV493載體與雙鏈DNA連接并轉(zhuǎn)化。

1.2.2 PCR鑒定陽性克隆轉(zhuǎn)化子及測(cè)序鑒定 挑取單個(gè)菌落作為PCR擴(kuò)增模板，設(shè)計(jì)引物序列如下：

F：5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′，

R：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。

將陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 慢病毒的包裝 將陽性克隆轉(zhuǎn)接于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后抽提質(zhì)粒。293T細(xì)胞以5×106/15 mL的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，將前述質(zhì)粒載體shRNA-SIVA1和輔助載體pHelper1.0、pHelper2.0混勻并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集293T細(xì)胞上清液，于4℃、4 000 g離心10 min，0.45 μm濾器過濾上清液，以25 000 r/min，4℃超速離心2 h，棄上清，冰PBS重懸病毒沉淀，分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.4 慢病毒滴度測(cè)定 將病毒原液按10倍濃度梯度稀釋并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞3～4 d，熒光顯微鏡觀察各孔GFP表達(dá)，計(jì)算病毒原液滴度：病毒滴度（TU/mL）=熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/病毒原液量。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-RCR）實(shí)驗(yàn) 將各組shRNA-SIVA1慢病毒載體及慢病毒陰性對(duì)照載體shRNA-NC分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901/DDP，72 h后收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入PCR引物并置于ABI 7500 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參。PCR的引物設(shè)計(jì)如下：

SIVA1 Forward：5′-TGTACCCTGTGTGGCCTCGT-3′，Reverse：5′-AGCCAGCCTCAGGTCTCGAA-3′；GAPDH Forward：5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，Reverse：5′-GACTCCACGACGTACTCAGC-3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 SIVA1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，選擇干擾效率最佳的shRNA-SIVA1序列進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，Western及IP裂解液提取細(xì)胞總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別用SIVA1（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、Bcl-xL（1∶500）和GAPDH抗體（1∶2 000）于4℃搖床孵育過夜，帶熒光標(biāo)記的羊抗兔第二抗體（1∶5 000）室溫避光孵育2 h，TBST洗膜3次，應(yīng)用Odyssey 3.0儀器掃描顯影并分析蛋白條帶，以目的蛋白條帶與GAPDH條帶積分光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞對(duì)DDP的藥物敏感實(shí)驗(yàn) 為探索沉默SIVA1后對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響，采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒載體后的細(xì)胞對(duì)DDP敏感性的變化。取各組細(xì)胞以5×103/孔鋪入96孔板，每組5個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置6個(gè)DDP濃度梯度（0.5、1、5、10、20、50 μg/mL）并加入相應(yīng)各孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。各組的吸光值為A處理，未經(jīng)藥物處理的吸光值為A對(duì)照，只含完全培養(yǎng)液的吸光值為A空白，計(jì)算各藥物濃度下的細(xì)胞存活率：（A處理-A空白）/（A對(duì)照-A空白）×100%。應(yīng)用Nosa軟件計(jì)算DDP對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8法檢測(cè)沉默SIVA1后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。取各組細(xì)胞以5× 103/孔鋪入96孔板，分別于各時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72、96 h）每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)并記錄各孔在450 nm波長(zhǎng)處吸光值，繪制各組細(xì)胞的增殖曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism V 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制柱狀圖和折線圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-SIVA1重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定 將構(gòu)建成功的表達(dá)載體的陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果如圖1所示，與設(shè)計(jì)的shRNA寡核苷酸序列相符，提示SIVA1 shRNA寡核苷酸鏈序列正確插入GV493質(zhì)粒載體。

圖1 shRNA-SIVA1重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of shRNA-SIVA1 recombinant plasmid

2.2 重組慢病毒載體包裝和滴度測(cè)定 將shRNASIVA1重組載體與輔助載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并從細(xì)胞上清液收獲慢病毒載體。采用梯度稀釋法測(cè)得各組shRNA-SIVA1的病毒原液滴度均為2×109TU/mL，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 慢病毒載體對(duì)胃癌SGC-7901/DDP細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果 將慢病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901/DDP細(xì)胞（MOI=20）并觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示，各組shRNA-SIVA1慢病毒載體對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞均有良好的轉(zhuǎn)染效果。

2.4 轉(zhuǎn)染shRNA-SIVA1對(duì)SIVA1 mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與Control組和 shRNA-NC 組相比，shRNA-SIVA1-1、2、3組的SIVA1 mRNA表達(dá)均有不同程度降低（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組的SIVA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.27± 0.04）、（0.57 ± 0.09）和（0.61 ± 0.06），以 shRNASIVA1-1的抑制效果最顯著。

2.4 轉(zhuǎn)染shRNA-SIVA1對(duì)SIVA1蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染shRNA-SIVA1的SIVA1蛋白表達(dá)（0.44±0.04）顯著降低（圖4，P＜0.005），這一結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。

2.5 沉默SIVA1能降低細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性CCK-8藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組細(xì)胞［IC50=（13.80± 0.62）μg/mL］和shRNA-NC［IC50=（14.27±0.93）μg/mL］相比，shRNA-SIVA1能顯著降低細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性［IC50=（20.97±0.91）μg/mL］（P＜0.005，圖5）。

圖2 慢病毒載體對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果Fig.2 The transfection effects of lentivirus vector on SGC-7901/DDP cells

圖3 shRNA-SIVA1對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞SIVA1 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of shRNA-SIVA1 on the expression of SIVA1 in SGC-7901/DDP cells

2.6 沉默SIVA1能提升細(xì)胞增殖活性 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和shRNA-NC組相比，shRNA-SIVA1細(xì)胞在接種2 d后增殖活性顯著提升（P＜0.05，圖6）。

2.7 沉默SIVA1能促進(jìn)Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，與Control組和shRNA-NC組相比，SIVA1沉默后Bcl-2（0.83± 0.03）和Bcl-xL的蛋白表達(dá)（0.61±0.06）顯著提高（P＜0.005）。

3 討論

圖4 shRNA-SIVA1對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞SIVA1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of shRNA-SIVA1 on the expression of SIVA1 protein in SGC-7901/DDP cells

圖5 沉默SIVA1對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞IC50的影響Fig.5 Effects of SIVA1 interfering on IC50of SGC-7901/DDP cells to DDP

圖6 沉默SIVA1對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of SIVA1interfering on the proliferation of SGC-7901/DDP cells

圖7 shRNA-SIVA1對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of shRNA-SIVA1 on the protein expression of Bcl-2和Bcl-xL in SGC-7901/DDP cells

隨著對(duì)腫瘤耐藥現(xiàn)象的深入研究，目前已認(rèn)識(shí)到腫瘤耐藥的發(fā)生主要涉及藥物外排增加、對(duì)藥物解毒作用的增強(qiáng)、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、促進(jìn)凋亡抵抗以及促進(jìn)生存的增加等機(jī)制［6］。而化療藥物殺傷腫瘤的一個(gè)重要作用方式即是通過損傷細(xì)胞DNA進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多。凋亡信號(hào)通路受損或功能異常則可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。大量研究表明，p53、Akt和NF-κB等凋亡相關(guān)分子和信號(hào)通路均參與了胃癌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程［7-8］。因此，對(duì)凋亡相關(guān)分子進(jìn)行深入研究能更好地理解胃癌耐藥的產(chǎn)生機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，SIVA1作為凋亡影響因子參與了p53引起的細(xì)胞凋亡［9］，此外，SIVA1還可通過抑制NF-κB的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］。然而隨著對(duì)SIVA1基因研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)SIVA1在不同類型腫瘤細(xì)胞中對(duì)凋亡的影響卻不盡相同。RAY等［11］發(fā)現(xiàn)，在p53缺失的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，低表達(dá)的SIVA1是DDP發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的主要障礙之一。在卵巢癌中，SIVA1可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并促使Stathmin蛋白發(fā)生磷酸化進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12］。LI等［13］在乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，SIVA1可以通過直接或間接作用的方式抑制Stathmin蛋白的微管解聚活性，促進(jìn)微管的生成和穩(wěn)定，阻止細(xì)胞遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，此外在小鼠動(dòng)物模型中，干擾SIVA1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果提示SIVA1可通過影響細(xì)胞凋亡并發(fā)揮抑癌基因的作用。然而在KRASG12D來源的非小細(xì)胞肺癌中，SIVA1表達(dá)升高并通過調(diào)節(jié)腫瘤代謝和自噬促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。在骨肉瘤中，SIVA1可影響p53穩(wěn)定性并促進(jìn)P53降解，從而抑制P53介導(dǎo)的凋亡，敲減SIVA1能抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［15］。綜上所述，SIVA1參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程并扮演重要的角色，但其發(fā)揮的具體功能可能依賴于不同的腫瘤類型。

慢病毒載體是在人類免疫缺陷型病毒的基礎(chǔ)上改造而成，相比于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，慢病毒載體對(duì)動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系具有更好的轉(zhuǎn)染性，具有轉(zhuǎn)染效率高、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，能持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)基因，現(xiàn)已作為轉(zhuǎn)移目的基因的理想載體被廣泛應(yīng)用［16］。本研究為了明確SIVA1在胃癌耐藥中所發(fā)揮的功能，首先構(gòu)建靶向SIVA1基因的慢病毒載體并將其轉(zhuǎn)染至胃癌耐藥細(xì)胞系中。結(jié)果顯示，本研究所構(gòu)建的慢病毒載體對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞具有良好的感染性，且能有效抑制細(xì)胞中SIVA1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

在隨后的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)抑制胃癌耐藥細(xì)胞的SIVA1表達(dá)后，不僅降低了細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，并且促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，提示SIVA1在胃癌耐藥細(xì)胞中可能發(fā)揮促凋亡作用進(jìn)而扮演抑癌基因的角色。

Bcl-2/Bcl-xL作為Bcl-2蛋白家族中的成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其作用方式是通過線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡［17］，從而影響腫瘤細(xì)胞的存活。研究表明，雷公藤甲素可通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡［18］。此外，沉默Bcl-2表達(dá)后，成骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡顯著增多，細(xì)胞存活減少［19］。上述結(jié)果提示，Bcl-2能發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。

為了進(jìn)一步探究SIVA1在胃癌耐藥細(xì)胞中的作用機(jī)制，筆者采用Western blot檢測(cè)了細(xì)胞Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默SIVA1后可引起凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)升高。這一結(jié)果與CHU等［20］的研究結(jié)論相一致。提示SIVA1基因可能通過Bcl-2和Bcl-xL參與了細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞藥物敏感性和增殖活性。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了靶向干擾SIVA1的慢病毒載體，初步探討了SIVA1在胃癌耐藥細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究SIVA1對(duì)胃癌耐藥的影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，本研究仍存在一些不足，僅在SGC-7901/DDP一株細(xì)胞上進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，SIVA1在其他胃癌耐藥細(xì)胞上是否也具有相同的效應(yīng)，以及如上述文獻(xiàn)所提示的p53、NF-κB分子，是否也參與了SIVA1對(duì)胃癌耐藥性的調(diào)控，這些問題仍需進(jìn)一步證實(shí)，也是我們下一步的研究思路。