乙型肝炎患者不同突變譜的乙肝表面抗原水平變化

申紅玉 張宏宇 陳敏 鄭國(guó)軍 朱珉之 杭雙熊

江蘇省常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇常州213001）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是一個(gè)嚴(yán)重的世界性健康問(wèn)題，全球約有2.48億人感染［1］。盡管近年來(lái)核苷類似物［nucleos（t）ide analogs，NAs］已在臨床上被廣泛用于抑制HBV復(fù)制，但HBV相關(guān)的肝硬化或肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）引起的死亡仍然逐年增加［2-3］。

HBV DNA與乙肝表面抗原（HBsAg）是臨床中反映病毒復(fù)制的兩個(gè)重要病毒學(xué)標(biāo)記，與病毒粒子的聚集和分泌密切相關(guān)，因此，這兩個(gè)標(biāo)記被用來(lái)評(píng)估慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的抗病毒治療反應(yīng)性［4］。一項(xiàng)研究報(bào)道，HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg與HBV DNA呈顯著正相關(guān)［5］，而另一項(xiàng)研究顯示，治療組和未治療組患者HBsAg與HBV DNA相關(guān)性較差［6］。因此，HBsAg與HBV DNA的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議［7-9］。

具有低耐藥基因屏障的NAs，包括拉米夫定（LAM）和阿德福韋酯（ADV），在過(guò)去10年中被廣泛使用，并導(dǎo)致耐藥突變體的流行。理論上，HBV基因組的開(kāi)放閱讀框重疊，逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）區(qū)域的突變可能影響HBsAg水平、傳染性以及病毒粒子的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，rtA181T突變導(dǎo)致S區(qū)sW172*取代，這是一個(gè)終止密碼子，對(duì)HBsAg的產(chǎn)生有負(fù)面影響［10-11］。耐藥突變r(jià)tM204I/sW196*也被報(bào)道為S基因［12］的一個(gè)終止密碼子。HBV野生型毒株與耐藥毒株共存，在NAs治療期間仍可產(chǎn)生HBV病毒粒子。野生型菌株和耐藥菌株可以相互補(bǔ)充，產(chǎn)生協(xié)同或互補(bǔ)作用［11，13］。然而，RT 區(qū)突變對(duì)HBsAg水平的影響尚不清楚。

在本研究中，筆者分析了大量RT區(qū)不同突變的CHB患者的HBsAg水平及其與HBV DNA的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)可以擴(kuò)展我們對(duì)HBsAg和HBV DNA之間關(guān)系的理解，且有必要對(duì)HBV突變患者的HBsAg水平進(jìn)行重新評(píng)估。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2011年7月至2018年12月在江蘇省常州第三人民醫(yī)院門診及住院患者2 843例。所有患者均為HBV感染者，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015）》［14］，并有拉米夫定（Lamivudine，LAM）或阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）治療史1年以上，應(yīng)答不佳的CHB患者。同時(shí)定期收集患者HBsAg滴度、HBV DNA載量、耐藥基因和肝臟功能等指標(biāo)。所有患者排除合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV等其他病毒性疾病、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。

將所有患者分為突變組和非突變組，其中突變組按照突變位點(diǎn)又被分為rtM204I/V、rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtA181T、rtN236T 和rtA181T+N236T六個(gè)亞組。

本項(xiàng)研究通過(guò)了常州市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)文號(hào)：常州市第三人民醫(yī)院醫(yī)倫［2018］第005號(hào)。

1.2 RT區(qū)基因測(cè)序 采用QIAamp試劑盒（德國(guó)）提取血清HBV DNA，用巢式PCR擴(kuò)增HBV RT區(qū)域。第一輪PCR的正反向引物分別為：5′-ACTGTATTCCCATCCCATCAT-3′和 5′-TTCGTTGACATA CTTTCCAATCA-3′，第二輪PCR的正反向引物分別為：5′-CTTGACATACTTTCCAATCAA-3′和 5′-AAG GTATGTTGCCCGTTTGT-3′。PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序，檢測(cè)HBV RT區(qū)的耐藥相關(guān)突變。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 血清HBsAg和HBeAg水平是采用化學(xué)發(fā)光酶免法（雅培）檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果超過(guò)250 IU/mL的標(biāo)本進(jìn)行稀釋后復(fù)測(cè)；肝功能檢測(cè)采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；ALT的正常參考值為7～40 U/L；血清HBV DNA采用羅氏LightCycler 480II系統(tǒng)（瑞士）檢測(cè)，其檢測(cè)限為100 IU/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較，χ2檢驗(yàn)用于分類數(shù)據(jù)的比較，pearson相關(guān)分析描述兩個(gè)變量之間的相關(guān)性。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線特征 所有患者分為兩組：耐藥位點(diǎn)突變組和非突變組。患者基線特征見(jiàn)表1。在所有患者中，758例（26.7%）有耐藥位點(diǎn)突變，2 085例（73.3%）無(wú)耐藥位點(diǎn)突變。突變組的血清HBsAg滴度（1 771.87±868.57）IU/mL明顯高于非突變組（1 636.85 ± 857.27）IU/mL（t=3.677，P＜ 0.001），兩組HBeAg陽(yáng)性率亦差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.001，P=0.001）。突變組和非突變組的平均HBV DNA水平分別為5.22 log10IU/mL和5.75 log10IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.657，P＜0.001）。在血清ALT水平上，突變組（148.75±183.32）U/L明顯高于非突變組（103.47±132.69）U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.233，P＜0.001）。突變組患者的平均年齡（48.56±12.52）歲顯著高于非突變組（43.68±13.00）歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.928，P＜0.001），但在性別上兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.246，P=0.620）。

2.2 不同耐藥突變組和非突變組HBsAg定量與血清HBV DNA水平的相關(guān)性不同 所有患者HBsAg定量與血清HBV DNA水平的相關(guān)分析見(jiàn)圖1。非突變組血清HBsAg滴度與HBV DNA水平呈正相關(guān)（r=0.413，P＜0.01,圖1A），單位點(diǎn)突變組亦是如此（rtM204I/V：r=0.380，P＜0.001，圖 1B；rtA181V：r=0.258，P=0.008，圖 1E；rtN236T：r=0.369，P=0.004，圖1F），rtL180M+rtM204V聯(lián)合突變組的HBsAg滴度與HBV DNA水平也呈正相關(guān)（r=0.300，P＜0.001，圖1D）。但rtL180M+rtM204I突變組和rtA181V+rtN236T突變組血清HBsAg滴度與HBV DNA水平相關(guān)性較差，分別為（r=0.203，P=0.055，圖1C）和（r=0.159，P=0.217，圖1G）。

表1 基線特征（n=2 843）Tab.1 Baseline characteristics 例

圖1 非突變組與各突變組的HBsAg水平與HBV DNA載量間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between HBsAg and HBV DNA levels in the non-mutation and drug-resistant mutation groups.

2.3 rtL180M+rtM204I突變組的血清HBsAg滴度和HBV DNA水平變化趨勢(shì)不同于rtM204I/V和rtL180M+rtM204V突變組 rtM204I/V和rtL180M+rtM204V突變組血清HBsAg滴度明顯低于非突變組（t=-3.374，P=0.001；t=-3.733，P＜ 0.001），但rtL180M+rtM204I突變組與非突變組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.233，P=0.219，圖2A）。rtM204I/V、rtL180M+M204V、rtL180M+M204I三個(gè)突變組的血清HBV DNA水平均明顯低于非突變組（t=-6.541，P＜ 0.001；t=-5.735，P＜ 0.001；t=-2.906，P=0.009），然而L180M+M204I突變組的血清HBV DNA水平卻明顯高于M204I/V和L180M+M204V突變組（t=-4.362，P＜ 0.001；t=-3.763，P＜ 0.001，圖2B）。

2.4 與N236T突變組相比，A181T+N236T聯(lián)合突變對(duì)HBV DNA復(fù)制的影響較小，對(duì)血清HBsAg水平影響較大 rtA181T、rtN236T和rtA181T+rtN236T突變組的血清HBsAg滴度顯著低于非突變組（t=-3.636，P＜ 0.001；t=-2.037，P=0.032；t=-2.967，P=0.003），且rtA181T+rtN236T突變組明顯低于rtN236T單位點(diǎn)突變組（t=2.005，P=0.038，圖2D）。與非突變組相比，rtA181T、rtN236T和rtA181T+rtN236T突變組血清HBV DNA水平明顯降低（t=-4.127，P＜ 0.001；t=-3.711，P＜ 0.001；t=-2.295，P=0.022）。rtN236T和rtA181T+rtN236T突變組在HBsAg/HBV DNA比值上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.117，P=0.021，圖2F）。

圖2 非突變組與各突變組間的HBsAg水平、HBV DNA載量和HBsAg/HBV DNA比值的比較Fig.2 Comparison of HBsAg，HBV DNA and HBsAg/HBV DNA levels in patients with non-mutation and drug-resistant mutations

3 討論

近年來(lái)，隨著抗病毒藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥突變的出現(xiàn)已成為一種普遍現(xiàn)象。在臨床實(shí)踐中，HBsAg滴度和血清HBV DNA水平是HBV復(fù)制的重要病毒學(xué)標(biāo)記，它們常被用于評(píng)估CHB患者的抗病毒治療過(guò)程的療效［4］。

HBV DNA復(fù)制和HBsAg水平在HBV感染不同階段的表達(dá)機(jī)制尚不清楚。既往研究報(bào)道HB-sAg水平在免疫耐受期最高，以高HBeAg滴度和DNA負(fù)載為特征，HBeAg血清轉(zhuǎn)化后降低。另有研究報(bào)告顯示，HBeAg陽(yáng)性患者的血清HBsAg滴度高于HBeAg陰性患者，且與HBV DNA水平呈正相關(guān)［15］。筆者的研究結(jié)果也顯示，無(wú)論是在非突變組還是在不同的單位點(diǎn)突變組，血清HBsAg滴度與HBV DNA水平呈正相關(guān)。值得注意的是，在rtL180M+rtM204I和rtA181V+rtN236T這兩個(gè)組合突變組中，血清HBsAg滴度與HBV DNA水平無(wú)相關(guān)性。提示rtL180M+rtM204I和rtA181V+rtN236T組合突變可能會(huì)影響病毒復(fù)制的狀態(tài)，從而打破HBsAg表達(dá)與病毒復(fù)制的平衡。血清HBsAg滴度可以預(yù)測(cè)抗病毒治療中的病毒學(xué)反應(yīng)，早在許多年前就有報(bào)道［16-18］。其在HBV感染的自然過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，監(jiān)測(cè)血清HBsAg滴度可以幫助臨床醫(yī)生為患者選擇合適的治療機(jī)會(huì)和最佳的治療方案［19］。HBsAg的滴度可能受到HBV基因組突變的影響，包括preS、precore和基底核啟動(dòng)子區(qū)域［20-21］。RT區(qū)突變可影響HBV逆轉(zhuǎn)錄，影響松弛環(huán)狀 DNA（rcDNA）的形成及其向 cccDNA［13］的轉(zhuǎn)化。此外，HBV以準(zhǔn)種的形式存在。在野生型菌株與耐藥菌株共存的條件下，NAs治療仍可產(chǎn)生突變體病毒粒子［11］。因此，在長(zhǎng)期治療期間，耐藥突變對(duì)HBsAg的影響仍然令人關(guān)注。筆者的結(jié)果表明，不同的突變對(duì)血清HBsAg滴度和HBV DNA水平均有不同程度的影響，其中rtL180M+rtM204I突變組的血清HBsAg滴度較非突變組沒(méi)有明顯差別，但其HBV DNA水平卻明顯低于非突變組，提示rtL180M+rtM204I的聯(lián)合突變可以促進(jìn)空載體病毒顆粒的增加。

與rtN236T單位點(diǎn)突變相比，rtA181T+rtN236T組合突變對(duì)HBV DNA復(fù)制的影響較小，對(duì)血清HBsAg分泌的影響較大，即rtA181T+rtN236T組合突變組的HBsAg/HBV DNA比值較rtN236T單位點(diǎn)突變組低，因此筆者推測(cè)可能是A181T+N236T組合突變抑制了S基因的表達(dá)，或?qū)е翲BsAg分泌紊亂并聚集在肝細(xì)胞中。但其機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，HBV基因組RT區(qū)突變可能影響血清HBsAg滴度及其與HBV DNA的相關(guān)性。因此，HBsAg與HBV DNA的相關(guān)性在NAs治療中需要重新評(píng)估，特別是對(duì)于耐NAs的患者，有助于臨床調(diào)整治療方案。