ESR1、MYOD1和hTERT基因啟動子DNA甲基化與宮頸癌放化療敏感性的關系

沈蘭 陳春華 葉冬云 南方

宮頸癌在中國是女性中第二位常見的癌癥，是女性因癌癥死亡的重要原因[1]。宮頸癌早期階段采用手術治療，而局部晚期(FIGO分期ⅡB/Ⅲ)的主要治療方法是化學放射治療。患者的總體和無病生存取決于腫瘤分期，而在給定的FIGO分期內，這將取決于腫瘤對治療的反應[1]。在我們的設置中，大多數患者存在局部晚期疾病，并接受化學放射治療。因此，重要的是能夠預測這一群體的治療反應，并確定那些對化學放射治療(化學放射抗藥性)反應較差的人，他們的替代方法可能具有潛在價值。DNA甲基化異常是癌癥的特征之一，全球低甲基化和區域基因啟動子高甲基化是已知的致癌事件[2]。因此，DNA甲基化譜可以作為判斷預后的生物標志物和預后的預測因子。然而，關于基因啟動子甲基化作為宮頸癌預測指標的數據是有限的。我們對文獻進行研究，選擇了6個基因，即雌激素受體1(ESR1)、早發期1型乳腺癌(BRCA1)、RAS-關聯域族1異構體A (RASSF1A)、變異同系物1 (MLH1)、肌源性分化1 (MYOD1)和人端粒酶逆轉錄酶 (hTERT)，據報道，在浸潤性宮頸癌中甲基化的頻率為20%～70%[3]。我們排除那些很高或很低頻率的啟動子甲基化的基因，因為它們可能沒有預測價值[4]。選擇的基因具有不同的細胞功能，參與細胞分化(ESR1)[5]、細胞增殖(RASSF1A、MYOD1)[6]、放療/化療后DNA修復(MLH1、BRCA1)[7]和永生化(hTERT)[8]的調控。本研究推測，這些基因的啟動子甲基化狀態或轉錄水平可能與侵襲性宮頸癌對化學放射的整體反應有關，本研究目的是評估ESR1、MYOD1和hTERT基因啟動子甲基化譜和相應的轉錄本表達情況，以確定能夠預測化學放射治療患者的反應基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究是在倫理委員會批準后進行的，審批標準依據1975年赫爾辛基宣言(2000年修訂)在細胞學系分子病理學實驗室進行的。此項研究獲得受試者知情同意，并在2015年1月至2018年11月招募149例患者的連續隊列，其中41例因社會和經濟原因而退出。取常規的宮頸活檢進行組織病理學診斷，其中小部分組織切片被快速冷凍并保存在-80℃。對70%以上腫瘤組織進行冰凍切片/觸摸印跡涂片鑒定后，對標本進行分子分析。診斷時患有Ⅳ期疾病的患者、接受過任何形式治療的患者和無法完成整個治療過程的患者都被排除。排除41例后，108例浸潤性宮頸癌(年齡27～70歲)在FIGOⅡB/Ⅲ期符合本研究的納入標準。

1.2 治療方案與患者隨訪 化學放射治療采用四野箱照射技術，采用46 Gy/23分度外束照射，每周劑量為40 mg/m2順鉑，三維適形放射治療。在治療或完成治療結束時進行腔內近距離治療，包括2組高劑量率，間隔1周(每組9 Gy，高劑量率)。治療方案完成后，第1年每2個月隨訪1次，5年內每3個月隨訪1次，5年 后每6個月隨訪1次。隨訪過程中，對患者進行臨床檢查、血常規、腎、肝功能等生化評價及相關的影像學檢查，包括B超、骨盆、腹部、胸部CT掃描。沒有盆腔控制患者在放射門戶內被認為是淋巴區失敗，而上述放射門戶被認為是失敗，包括主動脈旁疾病和全身轉移。在上述隨訪基礎上，6例患者治療過程中發生全身或遠處轉移，因此被排除在進一步的分析之外。這些患者沒有任何局部疾病的證據。建議他們在各自的家鄉/村莊進行姑息治療。在其余102例患者中，27例表現為局部淋巴結衰竭(局部疾病證據，LED)，包括在治療或復發過程中殘留的頸部疾病和(或)盆腔淋巴結的患者，這些病例在化療方案完成后1～18個月發生。其余75例患者在完成化療方案后36～60個月的隨訪中無疾病(無疾病證據，NED)。

1.3 Taqman探針化學甲基化分析(甲基光法) 檢測ESR1、BRCA1、RASSF1A、MLH1、MYOD1和hTERT基因啟動子的甲基化狀態。基因組DNA和RNA提取從25～30 mg的組織樣本使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)按照制造商的指示。用TaqMan探針和引物序列對DNA進行亞硫酸鹽修飾，然后進行實時聚合酶鏈反應(PCR)。每個探針在5’端用6-FAM(熒光素酰胺)標記，在3’端用BHQ 1(黑洞猝滅劑1)標記。以外周血單個核細胞SSS 1甲基化修飾DNA為陽性對照；無模板構成陰性對照；ACTB管家基因為參考基因(Cp為15～20)。每個PCR反應含有12.5 μl Taqman mastermix (德國Hilden公司)，600 nmol/L各引物(Eurofin MWG Operon，AL，USA)，200 nmol/L探針，2 μl(100 ng)修飾DNA，最終體積為25 μl。采用標準運行條件，在ABI 7500實時PCR機(美國Applied Biosystems公司)上進行了實時PCR：初始變性為95℃ 10 min，95℃變性15 s，引物退火1 min，40次循環。所有樣本均為一式兩份。Cp值為30或更高被認為是甲基化產物的陰性。

1.4 基因轉錄水平的絕對定量 以DNase處理的總RNA為原料，根據生產廠家的指示，采用第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Fermentas Life Science公司)合成cDNA。基因表達采用SYBRGreen 1實時PCR(qRT-PCR)方法，用前面描述的引物序列進行絕對定量。每個PCR反應含有10 μl SYBR green master mix(德國Roche Applied Science公司)，各引物200 nmol/L，1 μl (100 ng)cDNA，終量為20 μl。以管家基因(ACTB)為參照基因，對DNA濃度的變化進行正常化，無模板構成陰性對照。qRT-PCR是在LightCycler 480(Roche Applied Science)上使用以下方案進行的：初始變性為95℃ 10 min，95℃變性15 s，引物退火20 s，72℃ 20 s(延伸熒光檢測)，40次循環。以管家基因(ACTB)為參照基因，對DNA濃度的變化進行正常化，而不以模板對照作為陰性對照。利用模板DNA的平均分子量和阿伏加德羅常數，計算了單位體積的拷貝數：(6.023×1023=阿伏加德羅常數，C=5×10-5g/ml，Mwt=bp×6.58×102g，OD260=260 nm吸收度)。原液按順序稀釋，得到一個標準系列，從105～1012份/ml，每份稀釋度相差10倍。標準曲線效率在1.7～2.0被認為是顯著的。試驗樣本的拷貝數由LightCycler 480軟件版本1.5.0.39(Roche Applied Science)自動計算。

1.5 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，定性或分類變量采用Pearson’s χ2檢驗或Fischer精確檢驗。為了評估與非甲基化或甲基化啟動子的任何基因組合對結果的影響，利用R統計計算軟件(R-3.1.1 for windows)，進行層次聚類分析和基因特征分析，實現群體間的區分，并對折疊變化數據集進行判別分析。在考慮平均值的一組中，每個基因生成熱圖，以2對數的折疊變化為顯著性。通過Mann-Whitney U檢驗，分析組織轉錄水平與患者預后的關系以及基因啟動子甲基化與組織轉錄水平之間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者生活型 本研究共納入102例浸潤性宮頸癌的病理診斷。平均年齡48.7歲(≥50歲44例，<50歲56例)。其中鱗狀細胞癌94例(角化48例，非角化46例)，腺癌6例。所有患者處于局部晚期，即FIGO ⅡB(n=50)或Ⅲ(n=52)，并接受相同的化學放射治療方案。ESR1、BRCA1、RASSF1A、MLH1、MYOD1和hTERT基因甲基化頻率分別為53%、63%、50%、42%、70%和66%。本研究未觀察到基因啟動子甲基化與患者的年齡和FIGO分期有任何顯著的關聯。基因啟動子甲基化與組織學類型的比較顯示ESR1基因啟動子甲基化與腺癌亞型顯著相關(P=0.028)。6例腺癌中ESR1基因啟動子甲基化率為100%，而鱗狀細胞癌為50%。在排除10例全身轉移瘤患者后，根據其結果和對化學放射治療的反應，可分為2組：化學放射敏感(NED，n=75)和耐化學放射線(LED，n=27)。2組年齡、FIGO分期、組織學類型等臨床或病理特征差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 基因啟動子甲基化與治療反應的關系 比較2組間基因啟動子甲基化和相應基因的表達情況，找出能預測化學輻射反應的最小基因組。通過單變量分析比較化學放射敏感組和化學放射抗性組，發現ESR1和MYOD1基因啟動子甲基化與治療反應顯著相關(P值分別為 0.05、0.03)。此外，分層聚類分析和交叉驗證表明，2組間的MYOD1、ESR1和hTERT基因啟動子甲基化差異有統計學意義(P<0.001)。與單因素分析的結果一致。進一步分析這三種基因的組合基因啟動子甲基化或未甲基化與化學放射反應的關系，觀察到非甲基化MYOD 1與甲基化hTERT基因啟動子和非甲基化MYOD 1與非甲基化ESR1基因啟動子組合可預測不良反應(P值分別為0.01、0.03)。見表2、3。

表1 患者特征 n=101

表2 浸潤性宮頸癌基因啟動子甲基化與化療反應的關系 例

2.3 ESR1和hTERT基因啟動子甲基化頻率與HPV 16/18感染的關系 從102例納入診斷研究的樣本中，選取40例進行宮頸病變不同階段ESR1和hTERT基因啟動子甲基化頻率與HPV 16/18感染的關系，同時入選的還有CIN 1、2、3級患者各10例，正常對照組40例。結果顯示，對于ESR1，40例正常宮頸標本和10例CIN 1組織樣本均未被甲基化。10例CIN 2中5例，10例CIN 3中7例，40例宮頸癌組織37例，甲基化率分別為50%、70%和92.5%。hTERT的甲基化頻率也呈上升趨勢，正常宮頸、CIN 1、CIN 2、CIN 3和宮頸癌組織的甲基化率分別為2.5%、0、30%、70%和87.5%。ESR1和hTERT的甲基化頻率與宮頸病變的嚴重程度相關(P<0.001)。HPV 16/18感染在正常宮頸(5/40)、CIN 1(1/10)、CIN 2(3/10)、CIN 3(5/10)和宮頸癌組織(27/40)中檢測到，且與宮頸病變的嚴重程度相關(χ2=29.957，P<0.001)。見表4,圖1。

表3 侵襲性宮頸癌中組合基因啟動子甲基化與化學放射反應的關系 例

注：M，甲基化等位基因；U，非甲基化等位基因

表4 宮頸病變不同階段ESR1和hTERT基因啟動子甲基化頻率與HPV 16/18感染的關系

注：Kruskal-Wallis h檢驗(比較各組間ESR1、hTERT和HPV 16/18比率)：χ2=79.416，P<0.001；χ2=70.016，P<0.001；χ2=29.957，P<0.001；Mann-Whitney U檢驗(CIN 1或更低和CIN 2或更高者ESR1、hTERT和hpv 16/18比率比較)：Z=-8.542，P<0.001;Z=-3.391，P=0.001，Z=-4.981，P<0.001

圖1瓊脂糖凝膠電泳分析ESR1和hTERT基因甲基化及高危人乳頭瘤病毒(hr-hpv)在宮頸病變不同階段的感染

注：A：ESR1；B=hTERT；W=水；M=Marker(100～600 bp)；m=甲基化特異性PCR產物；u=非甲基化特異性PCR產物；UN=未經修飾的DNA；1～3泳道=正常組織；4～6泳道=CIN組織；7～9泳道=宮頸癌組織

2.4 基因轉錄水平與預后的絕對定量 用絕對定量方法測定組織中ESR1、BRCA1、RASSF1A、MLH1、MYOD1和hTERT的轉錄水平，結果顯示化學放射敏感組(NED)和耐化學輻射組(LED)間差異有統計學意義。比較2組之間的中位轉錄水平，發現ESR1組織轉錄水平與應答顯著相關(P=0.036)。較低的ESR1轉錄水平與對化學放射治療的不良反應有關。經層次聚類分析，ESR1基因轉錄本在2組間差異有統計學意義(P<0.001)。未觀察到基因啟動子甲基化與我們隊列中相應的基因表達有統計學意義；然而，RASSF1A、MLH1和MYOD1基因轉錄表達與甲基化呈反向關系。見表5。

表5 浸潤性宮頸癌組織轉錄水平與化學放射反應的關系

注：Mann-Whitney U 測試

3 討論

本研究目的是從一組基因中尋找表觀遺傳生物標記物，這些基因可以預測浸潤性宮頸癌患者對治療的反應。所有患者在FIGO ⅡB/Ⅲ期接受放射治療，較單純放療治療浸潤性宮頸癌更有效，5年生存率由30%～50%提高到50%～70%。輻射治療通過細胞壞死和凋亡誘導細胞死亡。比較化療敏感組和化療耐藥組的基因啟動子甲基化模式和基因轉錄本表達，以確定能夠預測浸潤性宮頸癌患者對治療反應的最小基因組。目前還沒有單一的標記物或多種標記物可以預測放射治療的療效。

我們觀察到ESR1、MYOD1和hTERT的甲基化狀態可以預測結果。甲基化MYOD1預測了一個良好的結果，在浸潤性宮頸癌患者治療的化學放射治療。非甲基化的MYOD1基因啟動子對輻射反應的生物學意義尚不清楚[9]。MYOD 1編碼是一種參與肌肉分化的轉錄因子。因此，其表觀遺傳失調可能與細胞去分化或激活上皮間充質過渡通路有關，而這些途徑正被越來越多地認為與耐藥和耐輻射有關[10]。

ESR1啟動子甲基化也預示著化學放射治療的更好結果。此外，6例腺癌均顯示ESR1啟動子甲基化，5例為化療敏感，1例為耐藥。在最近的報告中，甲基化的ESR1與更高級別的腫瘤有關[11]，盡管其與宮頸癌的預后無關，然而，并沒有把它作為一種預測指標來評價。相反，MYOD 1和ESR1，甲基化hTERT預測的結果較差。hTERT是一種與端粒酶活性相關的潛在癌基因，筆者尚未見報道。在分析的其他基因中，RASSF1A和BRCA1缺乏與結果的相關性[12]。

基因拷貝數與疾病結局的分析表明，ESR1轉錄本水平的降低與化療耐藥有關。這一觀察得到相關研究[13]的支持，其中ESR1的表達缺失與宮頸癌細胞的侵襲性有關；浸潤性鱗狀細胞癌與高級別宮頸上皮內瘤變(CIN)相比，ESR1表達明顯下降。

啟動子甲基化與抑癌基因、細胞周期調控基因的沉默有關，而癌基因則與低甲基化引起的表達增加有關[14]。本研究分析的基因都沒有顯示甲基化和表達間有統計學上的關聯。只有少數研究已經評估基因啟動子甲基化和表達在宮頸癌，顯示出不同的結果[15]。癌前宮頸病變中DNA甲基化、hTERT mRNA表達與端粒酶活性之間無相關性。同樣，在某些宮頸癌細胞株中，ESR1的表達降低并伴隨甲基化，而在宮頸癌組織中則不是這樣。在其他幾種癌癥中，RASSF1A啟動子甲基化與其沉默有關。BRCA1，MLH1甲基化與轉錄水平無關；在宮頸癌中沒有類似研究。以往有關甲基化模式與基因表達相關的研究大多采用傳統的甲基化特異性PCR技術和傳統的基于凝膠的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術。使用TaqMan法和qRT-PCR等極其敏感的方法進行基因拷貝數的推導，可能會導致甲基化與基因表達無關的結果。另一方面，基因表達的調控是非常復雜的，可能是由微RNA、長非編碼RNA、組蛋白乙酰化等其他因素決定的，這些因素在癌癥中都發生了深刻的改變。有報告提示微RNA參與宮頸癌細胞的放射抵抗[16]。

如果有替代療法，通過甲基化分析來鑒定化療耐藥，可能會對患者有好處。表觀遺傳療法使用去甲基化藥物，在治療乳腺癌和肺癌等實體腫瘤的臨床試驗中顯示出一些前景。然而，目前仍沒有關于宮頸癌的資料，這將需要進一步的調查。