結直腸癌患者血清miR-542-3p和miR-203水平及臨床意義

岑小寧 黃許森 韋維 黃海舸 蘭海生

結直腸癌是我國成人常見的惡性腫瘤，每年新增約40萬病例，略高于發達國家(3%～4%)，嚴重威脅我國人民的健康和生命[1]。目前結直腸癌的發生機制尚未明確，普遍認為與年齡、生活習慣、體內激素變化和環境等因素有關[1,2]。由于結直腸生理位置特殊，早期癌變不易診斷，而早期診斷對癌癥的有效治療具有重要意義，因此深入探討結直腸癌的發病機制對結直腸癌患者的早期診斷、治療以及提高結直腸癌患者的生存質量具有重要臨床價值[3,4]。miRNA與腫瘤的發生發展、凋亡也有著密切的聯系，miR-542-3p通過各種多功能蛋白、生長因子信號、受體分子等參與細胞內周期進程的調控，并對細胞 DNA 的復制起始和增殖起到十分重要的作用[5]。miR-542-3p可通過抑制蛋白激酶 B信號通路進而抑制腫瘤內皮細胞增殖和集落形成。miR-203對免疫系統調控、血管生成和腫瘤轉移等方面發揮重要作用[6]。研究證實，miR-203基因突變時，表達降低時，腫瘤細胞無限制増殖、血管生成速度加快，且相關細胞因子如VEGF、P53等均表達增高[6]。因此本研究探討結直腸癌患者血清miR-542-3p和miR-203水平與臨床病理特征的相關性，為結直腸癌患者的早期診斷、治療提供理論及實踐依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2018年9月在右江民族醫學院附屬醫院胃腸外科行手術切除并經病理證實的結直腸癌患者134例為觀察組，其中男82例，女52例；年齡47～68歲，平均年齡(57.5±10.8)歲；病程6個月～11年，平均病程(5.36±2.14)年。符合美國國家綜合癌癥網(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCN CRC診治指南》中的診斷標準[7]，手術切除標本后行病理檢查以判定腫瘤最大徑、腫瘤數目、病理學分級、TNM分期、有無淋巴血管間隙浸潤、有無淋巴結轉移。選擇同期正常體檢者118例為對照組，其中男71例，女47例；年齡46～69歲，平均年齡(57.1±11.2)歲。結直腸癌患者及正常體檢者自愿提供血清，用作分析血清miR-542-3p和miR-203表達水平。2組在性別比、年齡、等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院附屬醫院倫理委員會審批。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①腸鏡下見腫瘤形態為潰瘍型或隆起型，病理結果為中、低、未分化腺癌或黏液腺癌；②所有研究對象簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①正在接受放化療治療的結直腸癌患者或患其他惡性腫瘤患者；②肝、腎、心功能異常者。

1.3 儀器與試劑 Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術公司產品)，miR-542-3p和miR-203mRNA的表達測定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)，實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)，超凈工作臺(上海恒躍醫療器械有限公司)，貝克曼庫爾特ACCESS2化學發光免疫分析儀及配套癌胚抗原定量測定試劑盒。

1.4 miR-542-3p和miR-203水平測定 結直腸癌患者于根治術前及術后3～4周采集全血，健康體檢者體檢時采血，2組皆清晨空腹肱靜脈抽血，置于10 ml無菌采血管中，室溫靜置30 min,4 500 r/min，離心10 min，分離血清，-70℃凍存備用，測定miR-542-3p和miR-203 mRNA 濃度和純度，實時熒光定量 PCR儀檢測其表達量。見表1、2。

表1 miR-542-3p、miR-203引物序列

表2 RT-PCR反應體系

1.5 血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平的測定 采用化學發光法檢測定結直腸癌患者及健康體檢者血清中CEA表達量。

2 結果

2.1 對照組和觀察組術前血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表達 觀察組術前miR-542-3p、miR-203水平低于對照組，CEA水平高于對照組(t值分別為26.682、15.932、31.136，P<0.05)。見表3。

組別miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)對照組(n=118) 3.48±0.153.15±0.172.54±0.56觀察組術前(n=134)1.78±0.72?1.95±0.86?12.78±3.76?

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 觀察組術前、術后血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表達 觀察組術后miR-542-3p、miR-203水平高于術前，CEA水平低于術前(t值分別為14.023、9.372、23.049，P<0.05)。見表4。

時間miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)術前1.78±0.721.95±0.8612.78±3.76術后2.98±0.68?2.89±0.78?4.77±1.43?

注：與術前比較，*P<0.05

2.3 不同臨床特征中血清miR-542-3p、miR-203水平比較 不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤數目特征組中血清miR-542-3p、miR-203水平差異無統計學意義(t值分別為0.138、1.200、0.068、0.172、0.069、0.055，P>0.05)；而病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結轉移、有復發，血清miR-542-3p、miR-203表達水平越低(t值分別為15.826、10.333、12.068、9.953、8.237、8.840、8.070、12.065、5.250、13.222，P<0.05)。見表5。

項目miR-542-3p t值P值miR-203 mRNAt值P值年齡(歲) <50(n=34)1.74±0.750.138>0.051.97±0.880.172>0.05 ≥50(n=100)1.76±0.721.94±0.83腫瘤最大徑(cm) ≥5(n=84)1.82±0.711.200>0.052.00±0.800.069>0.05 <5(n=50)1.79±0.782.01±0.82腫瘤數目 單發(n=45)1.75±0.830.068>0.051.89±0.990.055>0.05 多發(n=89)1.72±0.731.90±0.98病理學分級 低、中分化(n=85)2.20±0.3115.826<0.052.54±0.268.840<0.05 高分化(n=49)1.32±0.311.67±0.66TNM分期 Ⅰ～Ⅱ(n=70)2.30±0.2110.333<0.052.63±0.208.070<0.05 Ⅲ～Ⅳ(n=64)1.58±0.521.81±0.79淋巴血管間隙浸潤 無(n=52)2.17±0.3312.068<0.052.39±0.4112.065<0.05 有(n=82)1.40±0.401.47±0.46淋巴結轉移 無(n=90)2.40±0.129.953<0.052.08±0.735.250<0.05 有(n=44)1.58±0.541.52±0.49復發 無(n=72)1.98±0.528.237<0.052.37±0.4213.222<0.05 有(n=62)1.38±0.311.41±0.42

2.4 CEA與miR-542-3p、miR-203相關性分析 CEA與miR-542-3p、miR-203呈負相關(r=-0.569、-0.613，P<0.05)。見表6。

表6 CEA與miR-542-3p、miR-203相關性分析

2.5 ROC曲線及靈敏度、特異度分析 受試者工作特征曲線提示，CEA、miR-542-3p、miR-203ROC曲線下面積(AUC)分別為0.753(95%CI 0.602～0.798)，0.680(95%CI 0.523～0.745)，0.658(95%CI 0.569～0.779)，miR-542-3p、miR-203兩者的AUC相近，皆低于CEA，miR-542-3p、miR-203診斷結直腸癌的靈敏度、特異度相近(χ2=2.142、1.978，P>0.05)，皆低于CEA(χ2=8.986、10.541，P<0.05)。見表7，圖1。

表7 ROC曲線及靈敏度、特異度分析

3 討論

我國結直腸癌發病率逐年遞增，好發于30～60歲的成人，發病率為7.8%，在惡性腫瘤排名第四位，1994至2002年，結直腸癌發病率的增長率為7.9%[8]。在世界范圍內，結直腸癌成為危害人類健康排名第三的腫瘤，略低于肺癌，2014年，全球結直腸癌患者占所有惡性腫瘤15%，2015年高達27%，其病死率為25.03/10萬，占惡性腫瘤死亡病例的14.56%，2012年全球結直腸癌新發病例超過200萬，標化發病率為37.68/10萬，標化死亡率為15.54/10萬[9]。

miR-542-3p在腫瘤的發生發展中也扮演者重要的角色。研究表明，miR-542-3p對抑制細胞增殖發揮重要作用，并能強烈促進細胞凋亡，高度表達miR-542-3p的乳腺癌細胞株增殖能力低于高于野生株。低表達miR-542-3p蛋白的腫瘤細胞黏附內皮細胞的能力強，而腫瘤細胞與內皮細胞緊密結，才能穿過細胞外基質層,建立轉移灶[10,11]。本研究中，觀察組miR-542-3p水平低于對照組，且術后觀察組miR-542-3p水平高于術前觀察組，與CEA負相關，這與上述結論一致。miR-542-3p在人胚胎組織中廣泛表達，在正常的甲狀腺表達正常，甲狀腺癌患者miR-542-3p蛋白表達異常降低，而隨著甲狀腺癌患者TMN分期的進展，miR-542-3p表達逐漸降低，本研究中，病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結轉移、有復發，血清miR-542-3p表達越低，也證實了這一點。此外研究發現miR-542-3p蛋白對于腦膜瘤的發生發展具有重要的調控作用，其具有時間、空間表達特異性，若藥物激活miR-542-3p蛋白表達，腫瘤細胞的生長得到有效抑制，miR-542-3p可能成為腫瘤治療的分子靶點[12]。

miR-203在Hedgehog信號通路扮演著核心調節作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結合時，Ptch抑制跨膜蛋白受體(Smo)的活化，Smo被釋放，其下游細胞因子miR-203被活化，促進miR-203移位到細胞核內，進而抑制下游原癌基因[13]。本研究結果顯示，觀察組miR-203水平低于對照組，且術后觀察組miR-203水平高于術前觀察組，與CEA呈負相關，與上述結論一致。miR-203具有強烈的抑制血管生成作用，進而抑制癌細胞增殖和遷移：腫瘤細胞中一些血管活性因子(MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-8)與miR-203表達負相關。此外本研究發現，病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結轉移、有復發，血清miR-203表達越低，說明miR-203具有抑制癌細胞分化與侵襲遷移能力的作用，結合近期研究，IL-8、血管內皮生長因子(VEGF)由可能由miR-203調控，低表達miR-203的腫瘤細胞可促進IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在供應腫瘤生長的血管系統的形成及實體腫瘤的發展過程中發揮重要作用[14,15]。本研究同時也發現，miR-542-3p、miR-203在診斷結直腸癌的靈敏度、特異度相近，miR-542-3p、miR-203具有較高的靈敏度、特異度，可作為診斷結直腸癌的生物學標志物，值得在臨床上推廣應用。

綜上所述，miR-542-3p、miR-203在結直腸癌患者血清的表達量降低，miR-542-3p、miR-203在結直腸癌的發生發展過程中起抑制作用；miR-542-3p、miR-203具有較高的靈敏度、特異度，可作為診斷結直腸癌的生物學標志物，值得在臨床上推廣應用。