miR-146a和VEGF在視網膜中央靜脈阻塞伴發黃斑水腫患者房水中的表達及意義

郭清 張貴森 張寶東

視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)是較為常見的第二大視網膜血管病變疾病，其主要特征表現為視網膜水腫、出血，視網膜血液瘀滯、靜脈迂曲擴張[1]。CRVO發病機制較為復雜，為多因素致病，常與其他眼部疾病、心血管疾病相關。CRVO往往導致黃斑水腫，進而引起患者中心視力下降，嚴重影響患者生活[2]。因此CRVO伴發黃斑水腫也受到醫學界的重視。有研究表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在疾病的發展過程中具有重要作用[3]。研究發現，VEGF促進患者眼部血管新生，血管滲透，目前常使用抗VEGF藥物治療CRVO伴發黃斑水腫[4]。隨著對疾病的研究深入到基因層面，發現miR-146a在糖尿病視網膜病變中具有重要作用[5]。但miR-146a在CRVO伴發黃斑水腫中的研究筆者所見鮮有報道，故本研究探討CRVO伴發黃斑水腫患者房水中miR-146a與VEGF的表達，并分析其相關性和表達意義，為臨床診治提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2018年8月在我院就診的112例CRVO伴發黃斑水腫患者(研究組)，男52例，女60例；年齡30～65歲，平均年齡(51.18±5.37)歲；病程1周～13個月。另選取同期60例無眼部疾病的白內障患者為對照組，男26例，女34例；年齡30～67歲，平均年齡(50.37±5.61)歲。2組性別比、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經過相干光斷層成像(OCT)、熒光素眼底血管造影(FFA)檢查明確診斷為CRVO伴發黃斑水腫患者；②既往未使用抗VEGF藥物治療；③無其他眼部手術史；④經醫院倫理委員會批準，患者及家屬自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①具有高眼壓患者；②眼部活動性炎癥患者；③妊娠期和哺乳期患者；④患有全身其他系統性疾病，影響房水中細胞因子的表達。

1.3 方法

1.3.1 一般檢查:患者入院后接受全面的眼科檢查。患者經FFA、OCT(德國，Carl-Zeiss Medite公司)、眼底彩照進行確診，另外進行驗光、眼內壓(IOP)、最佳矯正視力、眼部B超、裂隙燈檢查，所有研究對象進行包括血常規、血壓、血糖、心率等的基本檢查，評價患者是否耐受玻璃體腔用藥。

1.3.2 房水采集:患者按照內眼手術規范進行消毒，用鹽酸奧布卡因滴眼液麻醉患眼，采用1 ml 注射器針頭于角膜穿刺入前房緩慢抽取房水0.1～0.5 ml，撤針后角膜穿刺口自閉。收集房水于不含熱源和內毒素的離心管中，15 000 r/min 離心10 min，避光保存于-70℃冰箱中。收集房水后使用開瞼器開瞼，結膜囊內消毒，于顳上方角膜緣處3.5～4.0 mm進行玻璃體腔注藥(雷珠單抗0.05 ml/0.5 mg)，注射結束后結膜囊內涂抗生素眼膏。

1.3.3 qRT-PCR檢測miR-146a與VEGF表達水平:取凍存的房水標本按照Trizol試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，將RNA反轉錄為cDNA并以相對應的cDNA為模板對miR-146a、VEGF進行qRT-PCR檢測。反應體系為25 μl：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl。反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；48℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環。引物均由上海生工公司合成。反應結束后收集數據進行Ct值分析，以GADPH為內參基因，采用2-ΔΔCt算法計算miR-146a、VEGF的相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 TNF-α、IL-6、VEGF水平檢測:采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測患者房水中TNF-α、IL-6、VEGF水平，試劑盒均購自上海酶聯生物，操作步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。

2 結果

2.1 2組患者臨床資料比較 2組患者年齡、性別比、高血壓比例差異均無統計學意義(P>0.05)；ELISA檢測發現，研究組TNF-α、IL-6、VEGF水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 2組患者房水中miR-146a、VEGF mRNA的表達水平比較 qRT-PCR檢測房水中miR-146a、VEGF mRNA的表達水平，結果顯示研究組中miR-146a(1.03±0.21)表達水平顯著低于對照組中miR-146a(7.93±1.51)水平，研究組中VEGF mRNA(3.45±1.02)表達水平顯著高于對照組VEGF mRNA(1.02±0.23)水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 2組患者臨床資料比較

組別miR-146aVEGF mRNA研究組(n=112)1.03±0.21?3.45±1.02?對照組(n=30)7.93±1.511.02±0.23

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 患者房水中miR-146a與VEGF的相關性 對患者房水中miR-146a與VEGF進行Pearson相關性分析，顯示miR-146a與VEGF呈顯著負相關(r=-0.659，P=0.001)，VEGF隨miR-146a水平的降低而升高。見圖2。

2.4 影響CRVO伴發黃斑水腫的多因素分析 將CRVO伴發黃斑水腫病情為因變量，以年齡、TNF-α、IL-6、miR-146a與VEGF為自變量并進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示TNF-α、IL-6與VEGF水平均是影響CRVO伴發黃斑水腫病情的危險因素，miR-146a是CRVO伴發黃斑水腫病情的保護因素，該病情與年齡無關。見表4。

圖2 miR-146a與VEGF相關性分析

表4 影響CRVO伴發黃斑水腫病情的多因素分析

3 討論

視網膜靜脈阻塞是常見的眼底血管疾病，根據阻塞部位不同可分為中央靜脈阻塞和分支靜脈阻塞。CRVO的病因與視網膜炎癥、高血壓、血流動力學、動脈硬化疾病等具有密切聯系[6]。目前對于CRVO伴發黃斑水腫的治療主要是玻璃體腔注射雷珠單抗、曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)、抗VEGF的藥物等，但是TA雖然短期內效果良好，但是隨著體內藥物濃度的減少，水腫會繼續出現，需要再次治療。部分藥物對疾病的治療不徹底，且容易引起患者眼壓升高，眼內炎癥等不良反應，抗VEGF的藥物的效果卻更加良好，所以VEGF在CRVO伴發黃斑水腫中的表達和意義有待進一步研究。有研究發現miRNA與多種疾病的發展具有密切聯系[3-6]，研究報道，miR-146a可調控機體的炎性反應和細胞重構[7]。目前關于VEGF、miR-146a在CRVO伴發黃斑水腫中的報道筆者所見較少，本研究探討VEGF、miR-146a在CRVO伴發黃斑水腫中的表達意義及關系，為治療CRVO伴發黃斑水腫靶點治療提供理論基礎。

VEGF廣泛存在于機體多種組織中，在眼部處于正常無疾病狀態時視網膜內皮細胞、視網膜色素上皮細胞及周細胞中均表達較低，其在眼部的低表達維持眼部正常[8]。缺氧狀態時視網膜細胞產生大量的VEGF，VEGF引起肌動蛋白纖維重構及通透性增加[9]。VEGF過表達引起血管的通透性增加、促進新生血管的形成造成眼內壓升高，導致視網膜出血、滲出、水腫，造成黃斑水腫[10]。有研究報道，CRVO患者房水、玻璃體腔中VEGF表達水平上調，其可能破壞了血-視網膜屏障[11]。IL-6可通過改變內皮細胞形態而引發內皮細胞通透性增加[12]。巨噬細胞和肥大細胞等炎性細胞在機體缺血、缺氧狀態下可刺激白細胞、血管內皮細胞釋放IL-6[13,14]。本研究通過qRT-PCR檢測房水中VEGF mRNA的表達水平，結果顯示研究組VEGF mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，說明VEGF在CRVO伴發黃斑水腫患者中高表達，其促進血管生成，引起黃斑水腫。本研究對房水中IL-6、VEGF水平進行ELISA檢測，檢測結果顯示IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)，表明IL-6可能在CRVO伴發黃斑水腫中發揮重要作用，且ELISA檢測發現VEGF蛋白水平與檢測 mRNA水平相一致，均顯著高于對照組。Logistic多因素分析顯示，VEGF、IL-6均是影響CRVO伴發黃斑水腫的危險因素，表明VEGF、IL-6均在疾病的發生發展過程中具有促進意義。

miRNA種類繁多，且多種mi RNA在機體的生理、病理過程中發揮重要作用。miR-146a與腫瘤、人體的衰老具有密切聯系，研究表明miR-146a可以下調癌細胞中的VEGF的表達[15,16]。研究表明miR-146a在老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)中表達較低，其受到TNF-α的誘導負調控IL-6的表達[17]。APRE-19細胞中過表達miR-146a可以抑制VEGF的表達，表明在AMD中miR-146a可能通過抑制VEGF的表達發揮其生物功能[18]。TNF-α可提高血管內皮生長因子、VEGF等的反應性[19]。TNF-α由活化的單核細胞和巨噬細胞產生，其刺激多種黏附因子、炎性因子的產生，引起血管及組織損傷[20]。本研究通過qRT-PCR檢測房水中miR-146a的表達水平，結果顯示研究組miR-146a mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，Pearson相關性分析顯示miR-146a與VEGF呈顯著負相關(r=-0.659,P=0.001)，說明miR-146a在CRVO伴發黃斑水腫患者中低表達，可能miR-146a對VEGF的抑制作用減弱，造成VEGF表達水平升高，造成黃斑水腫。本研究對房水中TNF-α水平進行檢測，結果顯示TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)，表明TNF-α可能在CRVO伴發黃斑水腫中發揮重要作用，其可能是刺激炎性因子的產生促進眼部炎性反應、促進VEGF的產生，引起血管增多。Logistic多因素分析顯示，TNF-α是影響CRVO伴發黃斑水腫的危險因素，miR-146a是疾病發展的保護因素，表明miR-146a可能對疾病具有抑制作用，可為疾病的治療提供靶點。

綜上所述，CRVO伴發黃斑水腫中miR-146a、VEGF表達水平相關，疾病發生、發展過程中可能是miR-146a對VEGF的抑制作用減弱，可為提高CRVO伴發黃斑水腫的診療效果提供新的研究思路。