lncRNA SNHG12在乳腺癌中的表達水平及臨床意義

張延濤 孫勇 張遠鵬

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，研究顯示，全球每年有大約130萬新增乳腺癌患者，其中約50萬乳腺癌患者死亡，病死率居女性惡性腫瘤前列[1]。目前乳腺癌發病率仍以3%的速度不斷增加，且呈現出年輕化趨勢，嚴重威脅女性的身體健康[2]。手術聯合放療、化療仍是治療乳腺癌的有效措施，一定程度上降低了該病的病死率，但對于部分晚期患者的治療仍未達到滿意效果[2]。研究表明，對乳腺癌預后的準確判斷是提高乳腺癌治療效果的關鍵[3]。然而乳腺癌的發病機制是一個多因素、多基因參與的復雜的過程，目前仍缺乏有效的生物標志物來反映乳腺癌患者的預后[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長度大于200 nt的非編碼RNA，lncRNA具有一系列生物學功能，在表觀遺傳調控、細胞分化調控、細胞周期調控等多種生命活動中均發揮重要作用，可能作為腫瘤學臨床應用的基礎。小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12)是一種具有低編碼概率的lncRNA，與膠質瘤等多種腫瘤患者的臨床特征有關，可能作為腫瘤預后的良好指標[4]。然而lncRNA SNHG12與乳腺癌疾病的發生發展及預后的關系尚不清楚。基于此，本研究通過探討SNHG12在乳腺癌中的表達水平，分析其臨床意義，以期為乳腺癌的治療及預后提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2013年10月在我院行手術切除的85例乳腺癌患者的癌組織及相應癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm處)，患者均為女性，年齡30～78歲，平均年齡(50.42±18.65)歲。本研究經醫院倫理委員會審核批準。手術切除組織后，用0.9%氯化鈉溶液洗去血污，迅速凍存于-80℃液氮之中保存備用。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合乳腺癌診斷標準[5]；②經影像學及病理學確診；③患者術前未經任何化療、放療或其他抗腫瘤治療；④患者自愿參與、配合本研究，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①心、肝、腎等重要臟器功能障礙患者；②精神精疾病患者；③嚴重呼吸系統、循環系統疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器：Trizol試劑、氯仿、異丙醇、RNA提取、焦碳酸二乙酯等試劑均購自賽默飛世爾科技有限公司，反轉錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Thunderbird SYBR qPCR Mix購自北京百靈克生物科技有限公司，內參β-actin的引物探針由上海生工生物有限公司合成。

1.3.2 RNA的提取：取乳腺癌組織及對應癌旁組織3 mm2的樣本解凍后，超聲勻漿，加入1 ml Trizol試劑，充分混勻并靜置10 min，加入300 μl氯仿并混勻，4℃、15 000 r/min離心機上離心10 min，棄上清，再加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，離心后棄上清，靜置15 min，晾干后加入焦碳酸二乙酯水溶解，瓊脂糖凝膠電泳后，測定RNA濃度及純度。

1.3.3 qRT-PCR：提取RNA并測定RNA濃度后，使用反轉錄試劑盒反轉錄得cDNA，采用Thunderbird SYBR qPCR Mix進行qRT-PCR檢測SNHG12的表達水平，反應體系20 μl，qRT-PCR反應條件：95℃：1 min；95℃：30 s；60℃：40 s，共40個循環。每個樣品設3組重復，采用2-ΔΔCT法對SNHG12表達水平進行定量分析。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 隨訪 隨訪日期自手術之日起至2018年10月31日，對所有患者進行復查或電話隨訪，隨訪時間為5年，記錄患者隨訪期間的生存情況。

2 結果

2.1 lncRNA SNHG12在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達水平比較 乳腺癌組織中lncRNA SNHG12表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

類別lncRNA SNHG12乳腺癌組織2.84±1.06癌旁組織 1.07±0.52t值13.821P值0.000

2.2 lncRNA SNHG12表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 以乳腺癌患者lncRNA SNHG12水平平均值為分界線，高于平均值為高表達，低于平均值為低表達。乳腺癌組織中lncRNA SNHG12表達情況與患者腫瘤直徑、淋巴結轉移及雌激素受體(ER)有關(P<0.05)，與患者年齡、組織學分級、臨床分期、遠處轉移、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體(Her2)無關(P>0.05)。見表3。

2.3 影響乳腺癌患者預后因素的Cox回歸分析 Cox模型單因素分析結果顯示：腫瘤直徑、淋巴結轉移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預后的危險因素；Cox模型多因素的分析結果顯示：腫瘤直徑、淋巴結轉移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預后的獨立危險因素。見表4。

2.4 lncRNA SNHG12表達水平與乳腺癌患者預后的關系 術后隨訪5年，共有15例患者死亡，其中lncRNA SNHG12高表達乳腺癌患者的5年總存活率為72.34%顯著低于低表達患者5年的總存活率92.31%，差異有統計學意義(χ2=5.614，P=0.018)。見圖1。

3 討論

乳腺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，發生部位為乳腺上皮組織，其主要臨床表現為乳腺腫塊、乳頭溢液、皮膚改變、乳頭乳暈異常及腋窩淋巴結腫等[6]。據統計，乳腺癌約99%患者為女性，約1%患者為男性，我國乳腺癌患者占全球乳腺癌女性患者的23%，略小于發達國家的27%[7]，近年來我國乳腺癌的發病率隨年齡的增長不斷增加，且有年輕化的趨勢，已成為威脅女性健康的第一大殺手，因此乳腺癌的防治研究已成為我國惡性腫瘤防治研究的重要任務[8]。然而乳腺癌的病因至今尚未完全清楚，研究表明，25歲以上女性、乳腺癌家族史、乳腺腺體致密、月經初潮早、絕經遲、未婚、未育、晚育、未哺乳、長期服用外源性雌激素長期過量飲酒等因素是導致乳腺癌發生的危險因素[9]。通過基因組學研究發現，乳腺癌的發病機制與原癌基因、抑癌基因及相關編碼蛋白質的改變有關，端粒酶激活原癌基因及抑癌基因失活可能引發一系列復雜的多基因、多階段協同作用的過程，進而導致乳腺癌的發生[10]。因此，通過研究分析乳腺癌相關腫瘤標志物不僅可以研究乳腺癌的發病機制，還可以對其預后情況作出判斷，從而采取一定的治療措施，提高患者生活質量，降低患者病死率。

表3 SNHG12與乳腺癌臨床病理特征的關系 例(%)

表4 影響預后因素Cox回歸分析

圖1miR-155-5p、ELK3表達水平與乳腺癌患者預后的關系

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，沒有蛋白質編碼能力，lncRNA異常表達參與多種生物調節過程，如胚胎發生、干細胞多功能性、細胞生長和惡性腫瘤發生。lncRNA表達水平可能與腫瘤患者的預后相關，可能作為腫瘤疾病的診斷和預后的生物標志物[11]。lncRNA SNHG12是一種被鑒定為在腫瘤患者中表達上調的新型lncRNA，在癌細胞增殖和遷移中發揮重要作用。Wang等[12]研究表明結直腸癌組織中SNHG12表達上調，且lncRNA SNHG12可促進結直腸癌癌細胞的增殖，抑制癌細胞的凋亡，可能是一種有用的生物標志物。Ding等[13]研究表明乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織和細胞中lncRNA SNHG12表達上調，且lncRNA SNHG12表達水平能夠調節癌細胞的增殖和轉移。本研究結果顯示，乳腺癌組織中lncRNA SNHG12表達水平顯著高于癌旁組織，提示lncRNA SNHG12可能與乳腺癌疾病的發生有關。可能是一種潛在的生物標志物。

目前已知影響乳腺癌患者治療療效預測及預后的影響因素主要有病理學和生物學因素兩類，臨床病理學因素有年齡、組織學分級、臨床分期、遠處轉移、淋巴結轉移、腫瘤大小等[14]。生物學因素指標有ER、PR及Her2的狀態等。Zhang等[15]研究表明lncRNA SNHG12在胃癌患者癌組織中表達顯著上調，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移等密切相關，SNHG12高表達患者存活期短，提示lncRNA SNHG12可能是胃癌患者預后的新的潛在生物標志物。Wang等[16]研究表明三陰性乳腺癌的lncRNA表達譜中，lncRNA SNHG12表達量顯著上調，其表達水平與腫瘤直徑與淋巴結轉移顯著相關。本研究結果顯示乳腺癌組織中lncRNA SNHG12表達情況與患者腫瘤直徑、淋巴結轉移及ER有關，提示lncRNA SNHG12表達水平與乳腺癌患者臨床特征有關，其表達上調可能提示不良預后。本研究術后隨訪5年結果顯示，共有15例患者死亡，其中lncRNA SNHG12高表達乳腺癌患者5年總存活率為72.34%，顯著低于低表達患者5年總存活率92.31%，提示lncRNA SNHG12高表達與不良預后有關，可能作為乳腺癌預后的良好指標。本研究進一步通過Cox模型多因素分析結果顯示，腫瘤直徑、淋巴結轉移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預后的獨立危險因素，提示lncRNA SNHG12可能對評價乳腺癌患者預后具有重要價值。

綜上所述，乳腺癌組織中lncRNA SNHG12表達上調，且其表達水平與患者的腫瘤直徑及淋巴結轉移等臨床病理特征有較大關系，提示lncRNA SNHG12表達水平對評價乳腺癌患者預后可能具有重要的參考價值，可能成為乳腺癌患者不良預后的生物標志物。然而本研究的樣本數量較少，下一步準備擴大樣本繼續進行深入的研究，以期為乳腺癌的臨床治療提供一定的參考依據。