miRNA-41調控c-myc在宮頸癌上皮間質轉化中的作用

朱亞 張偉 柯麗娜 朱承義 李斌

宮頸癌是全球女性中發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展作用機制復發(fā)，已知眾多分子參與調控這一錯綜復雜的過程，而針對單一基因設計的靶點藥物對腫瘤遏制效果并不理想[1,2]。侵襲是惡性腫瘤的重要特性之一，其與腫瘤細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密不可分[3,4]；EMT以上皮細胞特性的喪失及其間質細胞特性的獲得為主要特征，能使局限性生長的腫瘤發(fā)展成轉移性腫瘤，提高其侵襲能力[5]。腫瘤發(fā)生EMT過程中的標志是間質細胞標志分子Vimentin 表達升高， 細胞骨架重組，細胞間連接變得疏松等[6]。能誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT的因素比較多，包括炎癥刺激、化療藥物、紫外線、組織損傷、缺氧等[7]。MicroRNA即微小RNA(miRNA)，是指長度21～25 nt的小型非編碼RNA家族，其能夠識別特定的目標mRNA，可通過促進靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過程而發(fā)揮調控作用[8]。miRNA-41在多種惡性腫瘤中表達升高，并能夠通過抑制PTEN、PDCD4、p53等抑癌基因的翻譯過程參與調控多種惡性腫瘤的發(fā)生[9]。c-myc蛋白具有調節(jié)細胞增殖分化和促進細胞凋亡的作用，宮頸癌組織中伴隨有c-myc的過度表達和擴增[10,11]。本文探討miRNA-41調控c-myc在宮頸癌EMT中的作用，以明確miRNA-41的作用機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HeLa宮頸癌細胞系購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究室，培養(yǎng)于含10%熱滅活FBS，4 mmol/L谷氨酰胺，50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃與5%CO2濕潤培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，每隔3～5 d進行傳代。miRNA-41 mimic與miRNA-41 NC購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細胞分組與轉染 HeLa細胞隨機分為3組:空白組、對照組與miRNA-41組。取對數(shù)生長期細胞，待細胞融合度達到70%～80%后，對照組與miRNA-41組分別用EZ Trans細胞轉染試劑轉染miRNA-41 NC 與miRNA-41 mimic，轉染終濃度為10 nmol/L，轉染后12 h更換培養(yǎng)液，空白組不進行轉染。

1.3 qRT-PCR檢測miRNA-41表達 轉染后24 h與36 h，收獲細胞，用刮棒刮取細胞、4℃、1 000 r/min離心10 min，去上清，收集細胞。采用Trizol法提取細胞中的總RNA，采用SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)系統(tǒng)檢測miRNA-41表達，以GAPDH為反應體系內參照。

1.4 MTT法檢測細胞增殖指數(shù) 收集轉染后的HeLa細胞分別接種于96孔板，約5×103個/孔，轉染后24 h與36 h分別去除96孔板每孔中培養(yǎng)液，每孔加入180 μl新鮮DMEM培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去除孔內培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩培養(yǎng)10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值，計算細胞增殖指數(shù)。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲指數(shù) 將分裝好的Matrix 從-20℃冰箱中取出，在每個Transwell 小室中鋪膠100 μl，溫育3 h夾起Transwell 小室，向下室中加入600 μl含15%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉染后24 h與36 h，將細胞密度調整為4×105個/ml取100 μl細胞懸液垂直加入到Transwell小室中，培養(yǎng)24 h取出小室、固定細胞并精心染色，鏡下隨機取5 個視野進行拍照，記錄細胞相對侵襲指數(shù)。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期 轉染后36 h，胰蛋白酶消化收集細胞，離心后棄去上清，加重懸細胞，加入預冷的70%冰乙醇2～3 ml，吹打均勻，于4℃冰箱固定24 h以上。1 000 r/min 5 min離心棄去乙醇，重懸后加入碘化丙啶染液(PI染液，100 μg/ml)，室溫避光混合30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期。上述實驗都重復3次，取平均值。

1.7 Western Blot檢測c-myc與Vimentin表達 轉染后36 h，PBS洗滌細胞2次，取細胞，加入100 μl預冷的蛋白裂解液，裂解蛋白后分裝并在-70℃冰箱中保存。取20 μg蛋白進行Western Blot檢測應用商品化抗c-myc抗體和抗Vimentin抗體 (Abcam)，以GAPDH(Abcam)為內參照。

2 結果

2.1 3組miRNA-41表達水平比較 轉染后24 h與36 h，miRNA-41組的miRNA-41表達水平顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別24 h36 hmiRNA-41組23.44±2.4834.77±4.51對照組1.44±0.221.51±0.33空白組1.23±0.311.33±0.11 F值67.30298.022 P值0.0000.000

2.2 3組細胞增殖指數(shù)比較 轉染后24 h與36 h，miRNA-41組的細胞增殖指數(shù)顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組別24 h36 hmiRNA-41組134.59±24.03155.32±31.48對照組99.24±10.4298.76±9.22空白組95.92±9.7896.38±10.33 F值9.83312.430 P值0.0010.000

2.3 3組細胞周期比較 轉染后36 h，miRNA-41組的G1期比例較對照組和空白組顯著降低(P<0.05)，S期+G2期比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 3組細胞侵襲指數(shù)比較 轉染后24 h與36 h，miRNA-41組的細胞侵襲指數(shù)顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 c-myc與Vimentin表達比較 轉染后36 h，miRNA-41組的c-myc與Vimentin蛋白相對表達量顯著高于對照組和空白組，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

組別G1期S期+G2期miRNA-41組51.34±0.3348.77±0.24對照組60.00±0.6539.53±0.61空白組60.98±0.3338.92±0.55 F值5.7754.984 P值0.0080.012

組別24 h36 hmiRNA-41組1.56±0.441.78±0.56對照組1.02±0.081.07±0.11空白組1.03±0.111.06±0.05 F值23.10322.881 P值0.0000.000

圖1 3組c-myc與Vimentin表達比較

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。宮頸癌患者5年生存率一直不高，腫瘤轉移是宮頸癌致死的主要原因[12]。miRNAs 作為調控基因表達的一類非編碼小RNA，可參與機體大多數(shù)的生物學和病理學的進程，其主要通過與靶mRNA的核苷酸序列的堿基配對與互補調控轉錄后水平的基因表達。有研究顯示miRNA-41在宮頸癌細胞系中呈現(xiàn)為高表達，反義miRNA-41能夠抑制宮頸癌細胞系的生長[13]。還有研究顯示轉染反義miRNA-41寡核苷酸后，宮頸癌細胞增殖與侵襲能力被抑制[14]。還有學者采用qRT-PCR檢測miRNA-41的表達水平，結果顯示正常組織中miRNA-41表達水平很低，而宮頸癌組織中的表達量增加10倍以上[15]。宮頸癌的播散是指惡性宮頸癌在生長和發(fā)展過程中向鄰近組織直接侵襲和遠處轉移的過程，其中主要的特征為細胞侵襲。這個過程的發(fā)生發(fā)展一般都伴有細胞極性消失、與內皮細胞基底膜的粘附能力增強、細胞間的粘附能力下降以及細胞骨架重構等[16,17]。本研究顯示轉染后24 h與36 h，miRNA-41組的miRNA-41表達水平顯著高于空白組和對照組(P<0.05)；細胞增殖指數(shù)與侵襲指數(shù)顯著高于空白組和對照組(P<0.05)；轉染后36 h，miRNA-41組的G1期比例相對于對照組和空白組顯著降低(P<0.05)，S期+G2期比例則顯著增加(P<0.05)，表明miRNA-41的高表達能促進細胞增殖與侵襲，調節(jié)細胞周期。

癌細胞可以存在于各種表型狀態(tài)，其細胞可以保持上皮性狀與間充質狀態(tài)，可使癌細胞具有腫瘤發(fā)生潛力[18]。EMT是一種生物過程，癌癥相關的EMT有助于增加腫瘤細胞的侵襲性和轉移性，多種細胞因子可誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT[19]。Vimentin是中間纖維蛋白的一種，Vimentin高表達的結腸癌細胞系和乳腺癌細胞具有高度侵襲性，其在腫瘤中的表達上調是EMT發(fā)生的重要標志[20]。并且Vimentin的表達的逐漸上升是隨著分化級別的降低而進行的，在宮頸癌的發(fā)展轉移中發(fā)揮重要作用。c-myc癌基因的編碼蛋白由49個氨基酸殘基組成，在宮頸癌組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)c-myc 的過度表達[21]。有研究顯示在宮頸組織、宮頸炎癥，宮頸浸潤癌，c-myc的表達呈遞增趨勢[22,23]。c-myc 基因擴增及過表達與腫瘤細胞的無限增殖及增殖后結局密切相關，腫瘤惡性程度越高，c-myc的表達率越高[24,25]。本研究顯示轉染后36 h，miRNA-41組的c-myc與Vimentin蛋白相對表達量顯著高于對照組和空白組，空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明過表達miRNA-41能促進c-myc與Vimentin蛋白表達，從而促使EMT的發(fā)生，提高腫瘤增殖性與侵襲性。本研究也有一定的不足，沒有明確miRNA-41在宮頸癌的靶基因，miRNA-41對EMT的調控作用還有待進一步深入分析。

綜上所述，miRNA-41在宮頸癌細胞中的高表達能夠促進c-myc與Vimentin蛋白表達，從而促使EMT的發(fā)生，調節(jié)細胞周期，提高細胞增殖性與侵襲性。