RNA、lnc-EGFR對(duì)肝細(xì)胞癌免疫逃避調(diào)節(jié)的相關(guān)性

魏媛媛 田艷紅 李紅靜 張浩 李木松

免疫機(jī)制與肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，免疫逃避可協(xié)助清除入侵機(jī)體的病原體對(duì)正常細(xì)胞的損害[1]。癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，受免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響易分化、繁殖，既往臨床資料顯示HCC五年生存率日益降低[2]。最初研究認(rèn)為，炎性因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及腫瘤壞死因子可直接反映HCC患者機(jī)體免疫機(jī)制[3]。近年來文獻(xiàn)報(bào)道，RNA可在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，提示其可能為預(yù)測(cè)疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸更敏感指標(biāo)[4]。最新研究指出，細(xì)胞癌化后可引起表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)活化，且T調(diào)節(jié)細(xì)胞(T regulatory cells, Treg)和EGFR可共同表達(dá)[5]。本研究探討RNA、lnc-EGFR表達(dá)對(duì)HCC免疫逃避調(diào)節(jié)影響及其相關(guān)性，為臨床防治HCC提供具有臨床價(jià)值的信息。

資料與方法

一、臨床資料

所有HCC組織來自保定市第一中心病醫(yī)院病理檔案室，收集時(shí)間為2017年1月至2019年1月。研究由醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)驗(yàn)室和CT檢查高度疑似HCC；②最終經(jīng)病理診斷為HCC；③標(biāo)本保存完整；④年齡20～65歲；⑤臨床資料完整，各項(xiàng)檢查完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎、肺方面嚴(yán)重疾病；②有肝癌手術(shù)治療史；③住院資料不完整，各項(xiàng)檢查不完善；④合并自身免疫性、藥物性、細(xì)菌性、酒精性、化學(xué)毒物性肝病；⑤合并心血管系統(tǒng)及其他病毒感染疾病者。按照納入標(biāo)準(zhǔn)共選擇HCC標(biāo)本30份與癌旁正常組織30份。

二、方法

將HCC組織與癌旁正常組織分別充分剪碎研磨，加入組織裂解液(上海奧陸生物科技有限公司)及細(xì)胞裂解液(上海奧陸生物科技有限公司)充分反應(yīng)，采用含60對(duì)HCC組織和癌旁組織的組織芯片和免疫組化方法對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行染色。各組織中RNA、lnc-EGFR表達(dá)水平采用RT-PCR法檢測(cè)，化學(xué)因子及細(xì)胞免疫因子均采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

將HCC細(xì)胞株(上海斯信生物科技有限公司)隨機(jī)分為兩組，分別為RNA、lnc-EGFR抑制組與空白對(duì)照組，其中抑制組細(xì)胞給予RNA、lnc-EGFR抑制劑轉(zhuǎn)染，空白對(duì)照組細(xì)胞不作任何處理；轉(zhuǎn)染結(jié)束并更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液后，將兩組細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(試劑購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(購(gòu)自德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特，型號(hào)FC500)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況與細(xì)胞周期分布情況。

三、RT-PCR

采用Trizol試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)提取總RNA，并分析RNA完整性及純度；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(焦作路非凡生物科技有限公司)分別反轉(zhuǎn)錄RNA、lnc-EGFR得cDNA，將其凍存于-20℃?zhèn)溆茫籄BI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海奧陸生物科技有限公司)依次對(duì)cDNA進(jìn)行95℃預(yù)變性30 s、95℃變性10 s、61.4℃退火15 s，共循環(huán)39次。并重復(fù)PCR操作次數(shù)增加擴(kuò)增產(chǎn)物；閾值比較法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

四、 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

取肝臟組織剪碎、加RIPA裂解液，置于組織勻漿器中，離心半徑20 cm、10 000 r/min離心5 min，取總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；取總蛋白上樣、電泳變性、切膠、轉(zhuǎn)至PVDF膜上、TBS-T 25℃封閉1 h，加入兔抗人單克隆抗體(分別為CXCL12-CXCR4、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1，購(gòu)自北京紐樸生物技術(shù)有限公司)于4℃搖床孵育；PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)，4℃搖床過夜；PBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，用Image Quant TL軟件分析各條條帶的灰度值，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。采用GAPDH和β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)檢測(cè)目的蛋白大小進(jìn)行選擇，相對(duì)分子質(zhì)量為43×103的蛋白選擇β-actin，相對(duì)分子質(zhì)量為146×103的蛋白選擇GAPDH。

五、觀察指標(biāo)

HCC、癌旁正常組織中RNA、lnc-EGFR、化學(xué)因子、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表達(dá)情況，抑制組和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期變化情況。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、RNA、lnc-EGFR比較

癌旁正常組織中RNA、lnc-EGFR表達(dá)水平分別為(0.46±0.12)和(0.62±0.15)，HCC組織為(0.22±0.06)和(0.14±0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

二、化學(xué)因子比較

HCC與癌旁正常組織中CXCL12-CXCR4、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

三、細(xì)胞免疫因子比較

HCC與癌旁正常組織中IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

四、 RNA、lnc-EGFR與化學(xué)因子、細(xì)胞免疫因子相關(guān)性

HCC組織中RNA、lnc-EGFR與CXCL12-CXCR4為負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α為正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

五、細(xì)胞情況比較

兩種組織中細(xì)胞相對(duì)吸光度、凋亡率、周期占比比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

討 論

發(fā)生HCC的機(jī)制較復(fù)雜，且病情進(jìn)展缺乏規(guī)律性，具有高致殘率和高復(fù)發(fā)率。有學(xué)者指出，肝癌細(xì)胞為可溶性免疫抑制因子，可刺激B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生大量免疫因子，其對(duì)疾病惡化和預(yù)后有較大影響[6]。

表1 HCC與癌旁正常組織中化學(xué)因子比較(±s)

表2 HCC與癌旁正常組織中細(xì)胞免疫因子比較(±s)

表3 細(xì)胞情況比較

C類具有生物活性小分子蛋白質(zhì)由效應(yīng)細(xì)胞分泌，參與癌細(xì)胞增殖與凋亡。C類蛋白可控制諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞遷移、周期、基因轉(zhuǎn)錄及其腫瘤增殖及凋亡中均有一定作用，已有研究證實(shí)其可作為預(yù)測(cè)HCC免疫逃避作用敏感性指標(biāo)[7]。Jiang等[8]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫因子可促進(jìn)新血管生成和免疫機(jī)制來抑制癌細(xì)胞異常分化發(fā)育。Attia等[9]報(bào)道，IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α表達(dá)水平對(duì)HCC免疫逃避作用的判斷具有較高特異性。綜上提示各細(xì)胞因子與HCC免疫逃避作用具有一定相關(guān)性，但劉璐璐等[10]報(bào)道，在HCC發(fā)展過程中可動(dòng)態(tài)監(jiān)控RNA水平來判斷預(yù)后，聯(lián)合特異性內(nèi)皮因子lnc-EGFR對(duì)癌細(xì)胞發(fā)展具有更高敏感性和特異性。RNA為多基因生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控因子，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)等多種病理生理過程密切相關(guān)。趙冀等[11]研究證明，RNA可作為原癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用。張金蓮等[12]報(bào)道，RNA在肝癌細(xì)胞表面呈高表達(dá)，且其可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lnc-EGFR在人舌癌中呈高表達(dá)，且高水平的lnc-EGFR提示患者預(yù)后不良。另有學(xué)者指出，Lnc-EGFR高表達(dá)組織中，F(xiàn)OXP3表達(dá)和Treg細(xì)胞在T細(xì)胞中占比也上調(diào)，提示其對(duì)免疫逃避作用具有高敏感性[14]。本研究結(jié)果顯示，RNA、lnc-EGFR在癌組織中水平更高，與上述文獻(xiàn)結(jié)論較為一致，證實(shí)其與HCC發(fā)生有一定關(guān)系。探究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Treg信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、器官形成、組織再生過程中具有重要作用，而RNA、lnc-EGFR可上調(diào)其表達(dá)水平，提示其與HCC形成、發(fā)展有密切聯(lián)系。化學(xué)因子與細(xì)胞免疫因子是Treg信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子，蔡宗發(fā)等[15]研究證實(shí)，化學(xué)因子和免疫細(xì)胞因子在HCC組織中表達(dá)缺失可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)加速。

本研究中，HCC組織中CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1及細(xì)胞免疫因子IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α表達(dá)水平高于癌旁正常組織，提示RNA、lnc-EGFR對(duì)化學(xué)因子、細(xì)胞免疫因子具有上調(diào)作用來逃避免疫機(jī)制。本研究中抑制組細(xì)胞吸光度和凋亡率優(yōu)于空白對(duì)照組，提示RNA、lnc-EGFR對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，減緩其凋亡。G0/G1期在細(xì)胞周期中表示細(xì)胞增殖較活躍，本研究中抑制組G0/G1期細(xì)胞率大于對(duì)照組，但G2/M期細(xì)胞率小于對(duì)照組，提示RNA、lnc-EGFR可增加HCC細(xì)胞增殖活性。

綜上所述，RNA、lnc-EGFR與HCC免疫逃避機(jī)制呈顯著相關(guān)性，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞株早期凋亡。