血清mRNA-122對藥物性肝損傷患者早期藥物肝毒性評價的價值

寇曦曦

臨床上肝毒性評價方面主要依賴超微病理學、臨床生化指標(如總膽汁酸、血清轉氨酶等)、活性代謝產物、組織病理學、免疫相關指標，但這類指標穩定性、靈敏性、特異性較差，無法為其提供早期確切信息[1]。近幾年，有報道顯示肝特異性mRNA-122(microRNA-122，miR-122)調控肝細胞生長、發育、分化、代謝、應激等過程，相較于傳統肝毒性評價指標，其能準確區分肝外損傷與肝損傷；與組織病理學結果具有明顯相關性，有望成為早期藥物肝毒性評價的生物標志物[2]。但目前鮮有關于miR-122評價藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)患者早期藥物肝毒性的報道，故本文開展相關研究，旨在為DILI防治提供參考依據，報道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2016年4月至2019年4月于我院收治的84例DILI患者為對象，獲我院醫學倫理委員會批準。診斷標準：參考《藥物性肝損傷診治指南》[3]，均經肝穿病理確診為急性藥物性肝損傷，排除其他病因所致肝損傷；存在與藥物性肝損傷發病規律一致的潛伏期；停藥后異常肝臟指標迅速恢復；再次用藥反應呈陽性。納入標準：(1)年齡>18歲，首次發病；(2)均于用藥1個月內出現肝功能損害，白細胞增加，伴發熱、皮疹、黃疸、瘙癢等初發癥狀；(3)藥物淋巴細胞刺激試驗呈陽性；(4)偶然用藥后再次出現；(5)抗丙型肝炎病毒抗體、乙肝表面抗原、抗人類免疫缺陷病毒抗體檢測結果均呈陰性；(6)知情同意。排除標準：(1)既往有過量飲酒史；(2)伴自身免疫性肝炎、脂肪性肝炎、腦出血、病毒性肝炎、酒精性肝炎及其他嚴重肝臟疾病；(3)伴心、腦、腎、肺等嚴重臟器功能障礙及精神疾患者；(4)肝癌及其他惡性腫瘤。將納入的84例DILI患者設為觀察組，另選取同期入選的90例健康體檢者為正常對照組，兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較[(±s)，n(%)]

二、 方法

(一)miR-122檢測 采用Trizol試劑盒 (日本Takara公司)提取血清中總RNA，應用Nanodrop ND-1 000分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，以分光光度法行總RNA濃度和純度檢測。采用Prime-Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)逆轉miR-122，逆轉錄試劑包括樣本RNA 1μg、DEPC水13 μL、Bulge-loop RT Primer 2 μL、反轉錄酶5×Prime-script RT Enzyme Mix 2 μL、反應緩沖液5×Primescript Buffer 4 μL。逆轉錄條件：42℃60min，70℃10min。將miR-122逆轉錄為cDNA后置于-20℃保存。內參基因取U6，采用逆轉錄實時熒光定量PCR方法(熒光定量PCR儀Step one plus，美國Applied Biosystems公司生產)測定U6、血清miR-122。反應體系：cDNA 2 μL，SYBR Green solution 10 μL，上下游引物均為0.4 μL，去離子H2O 7.2 μL。反應條件：95℃預變性10min，95℃變性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循環40次，軟件分析Ct值。引物由美國SBI公司合成。采用公式2-△△Ct，對miR-122在DILI中的相對表達量進行計算，ΔCt=miR-122Ct-U6Ct。

(二)肝功能指標檢測 采用HITA-CHI-7080型全自動生化分析儀(日本日立產業株式會社生產)及相配套試劑，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、門冬氨酸氨基轉移酸(aspartate transaminase，AST)。

三、 觀察指標

觀察兩組miR-122表達及肝功能指標TBil、AST、ALT、ALP水平，分析miR-122表達與上述肝功能指標的相關性。

四、 統計學方法

結 果

一、 兩組miR-122表達及ALT、TBil、ALP、AST水平比較

觀察組miR-122表達及ALT、TBil、ALP、AST水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

二、 DILI患者血清miR-122表達與ALT、TBil、ALP、AST的相關性分

經直線相關分析顯示，DILI患者血清miR-122表達與ALT、AST水平呈線性正相關(r=0.662、0.698，P=0.000、0.000)，與TBil、ALP水平呈線性正相關(r=0.732、0.624，P=0.000、0.000)，見圖1～4。

表2 兩組miR-122表達及ALT、TBil、ALP、AST水平比較(±s)

圖1 miR-122與ALT的線性相關圖

圖2 miR-122與TBil的線性相關圖

圖3 miR-122與ALP的線性相關圖

圖4 miR-122與AST的線性相關圖

討 論

miR-122處于人類基因組第18號染色體，屬內源性小分子單鏈RNA，可經調節其作用靶基因調控基因轉錄后表達。目前臨床證實肝特異性表達的miR-122在肝組織中呈高度表達，表達量為肝中miRNAs的70%以上，在其他組織中呈低表達或不表達[4-5]。古巧燕等[6]采用乙酰氨基苯酚灌胃法建立急性藥物性肝損傷動物模型，發現模型組灌胃8、16、24 h時血清miR-122水平較對照組有顯著差異，且與ALT、AST水平呈正相關，與ALP、TBil水平無明顯相關性(可能與動物模型病理損傷部位有關)，推測急性藥物性肝損傷血清miR-122水平升高預示肝細胞損傷加重。

本研究結果顯示，觀察組miR-122表達及ALT、TBil、ALP、AST水平均明顯高于對照組，而直線相關分析顯示DILI患者血清miR-122表達與上述肝功能指標均呈線性正相關，推測miR-122可能參與DILI發病過程，筆者推測，可能與miR-122特性有關，miR-122主要經與編碼區堿基和靶mRNA 3’-或 5’-非翻譯區互補配對，對靶mRNA穩定性進行調整，轉錄后水平對靶基因表達起著調控作用。而miR-122水平改變往往早于蛋白水平，可經組織細胞損傷致其被動漏出方式，或經微泡分泌后以RNA結合蛋白形式進入血液循環。發生藥物性肝損傷時，血清miR-122表達顯著升高，與肝組織病理學變化程度和血清ALT、TBil、ALP、AST存在明顯相關性，與其檢測方法(實時定量PCR)的高特異性、高敏感性也有關。也有報道認為循環中miR-122表達水平明顯上調，推測組織損傷時其與循環中AST、ALT類似，由受損組織細胞分泌而來，能更好反映肝細胞損傷程度[7]。

綜上，血清miR-122在DILI患者早期藥物肝毒性評價中具有重要價值，臨床應引起足夠重視。但因樣本量偏小，未涉及其他種類的miRNAs，并未探討不同DILI病理類型、嚴重程度與血清miR-122的關系，故今后有待進一步深入調查研究。