過表達SCN4B對前列腺癌增殖和侵襲的影響

韋卓利 陶露 武世伍 宋早智項平

蚌埠醫學院第一附屬醫院中心實驗室病理科（安徽蚌埠233004）

據全球癌癥統計數據估計，2018年全世界有近130萬前列腺癌新發病例和359 000例相關死亡病例，是男性中第二大癌癥和第五大癌癥死亡原因[1]，五年生存率為72.6%[2]。目前前列腺癌臨床預后風險分級使用術前PSA 值，cTNM和Gleason評分是公認的，然而，有研究發現，即使患者具有相同的PSA，Gleason 評分和T 分期，其預后也可能完全不同[3-5]。因此，需要探索更好的預后指標來幫助預測不同前列腺癌患者。電壓門控鈉離子通道β4 亞基（SCN4B）作為α亞基的輔助亞基，不僅在細胞興奮中發揮重要的作用，還可以作為黏附分子，影響腫瘤細胞的黏附及遷移活動，定位于人染色體11q23.3 上的β4 亞基，有5個外顯子，編碼228個氨基酸殘基[6-7]。SCN4B在乳頭狀甲狀腺癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中[8-10]常表現為低表達，但有關SCN4B蛋白在前列腺癌中的表達與機制尚不清楚。本研究通過免疫組織化學Elivision TM plus 法檢測90例前列腺癌患者腫瘤組織中SCN4B蛋白的表達，并分析其與前列腺癌患者臨床參數之間的相互關系以及對患者生存期的影響。通過構建SCN4B 過表達載體探討SCN4B對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本及細胞株收集蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科2011年12月至2015年12月前列腺癌患者的存檔石蠟包埋組織標本90例，前列腺癌旁組織標本30例作為對照。前列腺癌組織標本按照Gleason 評分方法進行病理分級；采用AJCC 第八版的TNM 分期系統。所有患者術前均未行放化療以及其他抗腫瘤治療，均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，隨訪截止日期至2018年12月。本研究經過蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會的批準及患者的知情同意。前列腺癌細胞株（LNCAP、PC-3、DU145）購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑兔抗人多克隆抗體SCN4B（1∶100）購買于affinity公司（貨號DF6877），ElivisonTMPlus試劑盒和DAB 顯色試劑盒（福州邁新）。qPCR 引物購自上海生工，試劑盒購自TaKaRa，含有SCN4B的過表達質粒和空白對照質粒委托上海吉瑪公司構建完成。CCK8 試劑盒購自福州邁新，Transwell小室購自corning公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化染色方法活檢組織標本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。石蠟標本以4 μm/片連續切片，按照試劑說明書進行免疫組化染色。以PBS 代替一抗作陰性對照。 SCN4B蛋白主要定位于細胞質，呈黃褐色。每張切片隨機選擇3個不同的視野在高倍鏡下觀察，判斷陽性表達強度和陽性率。采用半定量分析方法對免疫組化結果進行評分[11]，染色強度計分：0 分（無明顯著色），1 分（弱染色），2 分（中度染色），3 分（強染色）[12]。每個視野陽性細胞所占的比例計分：1 分（＜25%），2 分（25%～50%），3 分（51%～75%）和4 分（＞75%）。最終得分為染色強度與陽性細胞數的乘積（0～12 分），得分≤6為低表達，＞6為高表達。

1.3.2 qRT-PCRTrizol 法提取3 種前列腺癌細胞株總RNA，并逆轉錄成cDNA。按照試劑盒說明書操作，以β-actin為內參，分別檢測LNCAP、PC-3、DU145細胞中mRNA表達。

引物如下：ACTB：上游：5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′，下游：5′-AGGATCTCCGTGCCATTGAC-3′；SCN4B：上游：5′-ACTGGGCTTTTGGGCCTCTT-3′，下游：5′-AGGATCTCCGTGCCATTGAC-3′。反應條件：95℃、3 min，95℃、12 s，62℃、40 s，重復40個循環。每個樣品設置3個復孔，采用2-△△CT法比較基因表達差異。

1.3.3 細胞轉染取對數期生長的DU145細胞為轉染對象，按1×106細胞/孔的濃度接種6孔板中。培養至70%融合時，根據LipofectamineTM2000 試劑說明書分別轉染空白對照質粒和過表達質粒。細胞根據轉染質粒不同分為空白對照組（PCDH 組）和過表達組（PCDH-SCN4B 組）。用qRT-PCR檢測轉染是否成功。

1.3.4 CCK-8取空白對照組（PCDH組）和過表達組（PCDH-SCN4B組）細胞消化后計數，1×103個/孔接種于96孔板中，在培養箱中分別培養24、48、72、96 h。在每個時間點更換培養基后加入10 μL CCK8/孔，并將細胞在37℃孵育2 h。取出后使用酶標儀檢測450 nm（OD450）的吸光度。

1.3.5 Transwell取PCDH 組和PCDH-SCN4B 組細胞消化后用無血清培養基調整細胞密度，按2×104/孔接種到鋪好基質膠的上室中，每孔200 μL；600 μL 含10%FBS的培養基加入下室。培養24 h后，取出上室，甲醇固定20 min，結晶紫染色20 min后用PBS 洗兩遍。選取4個高倍視野，計數后取平均值。

1.4 統計學方法采用SPSS 18.0 統計分析軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法，組間計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌和前列腺癌旁組織中SCN4B蛋白的表達情況90例前列腺癌組織中44例SCN4B蛋白高表達，30例癌旁組織中有3例低表達，差異有統計學意義（χ2= 15.740，P＜0.01）。在前列腺癌組織中，SCN4B的表達與前列腺癌的Gleason 分級、臨床分期、遠處轉移有關（P＜0.05），與患者的年齡、術前PSA 水平無關（P＞0.05）（表1、圖1）。SCN4B 高表達患者的總生存率高于SCN4B 低表達的患者（P＜0.05），差異有統計學意義（圖2）。

2.2 3種前列腺癌細胞株中SCN4B的表達以高轉移性細胞DU145為參考對象，PC-3和LNCAP細胞株中SCN4B表達均增強（P＜0.05，圖3）。

表1 各臨床病理指標與前列腺癌組織中SCN4B蛋白質的表達關系Tab.1 Relationship between clinical pathological parameters and expression of SCN4B protein in prostate cancer tissues

2.3 SCN4B 質粒的轉染驗證提取PCDH 組和PCDH-SCN4B 組細胞總RNA，通過qRT-PCR檢測轉染后SCN4B表達情況，結果發現，PCDH-SCN4B組SCN4B表達顯著高于PCDH 組（P＜0.01），證明轉染成功（圖4）。

2.4 過表達SCN4B對細胞增殖的影響CCK8 增殖實驗檢測結果說明：與PCDH 組相比，PCDHSCN4B 組的DU145細胞從第72 h 開始，增殖能力顯著降低（P＜0.05，圖5）。

2.5 過表達SCN4B對細胞侵襲的影響Transwell侵襲實驗說明：SCN4B 過表達顯著抑制DU145的侵襲能力（P＜0.05，圖6）。

圖1 不同病理分期SCN4B 免疫組化結果（×400）Fig.1 Results of different pathological stages of SCNB4 immunohistochemistry（×400）

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示90例SCN4B表達的前列腺癌患者的預后Fig.2 Kaplan-Meier survival curve analysis showing the prognosis of 90 patients with SCN4B expressing prostate cancer

圖3 SCN4B在3 種前列腺癌細胞株的表達Fig.3 Expression of SCN4B in three prostate cancer cell lines

3 討論

圖4 轉染后DU145細胞中SCN4B的相對表達量Fig.4 Relative expression of SCN4B in DU145 cells after transfection

圖5 SCN4B對細胞增殖的影響Fig.5 The effect of SCN4B on cell proliferation

圖6 SCN4B對細胞侵襲的影響Fig.6 The effect of SCN4B on cell invasion

SCN4B是新發現腫瘤轉移抑制基因，來自于電壓門控鈉離子通道，可調節鈉離子通道，誘導產生復蘇電流，也可影響鈉通道對動物毒液分子的敏感性。電壓門控鈉離子通道（VGSC）常在神經、肌肉、神經內分泌細胞中表達，近來發現VGSC 也在某些轉移的癌細胞中表達[13-14]，研究[15-18]表明，它在癌細胞中的表達增加了癌細胞的侵襲轉移。VGSC在腫瘤的轉移中有著重要的作用，其腫瘤機制復雜多變，目前的研究發現主要與以下因素有關[19-20]：（1）作為黏附分子，改變細胞形態，影響癌細胞的侵襲遷移；（2）調節α亞基的活性；（3）調節相互作用蛋白的表達量。

本研究證實了SCN4B蛋白在前列腺癌組織中存在表達，且SCN4B的陽性表達率顯著低于癌旁組織（P＜0.01），并隨著病理分期（T 分期）和Gleason 分級的增高SCN4B蛋白表達水平逐漸降低（P＜0.05），而與患者的年齡、術前PSA 水平間差異無統計學意義（P＞0.05），通過K-M 生存分析表明SCN4B 低表達的患者相對于SCN4B 高表達的患者有著較差的預后，說明SCN4B蛋白可能參與了前列腺癌的發生發展。然后本研究通過qRT-PCR檢測SCN4B在人前列腺癌細胞株（LNCaP，DU145和PC-3）中的表達高低，結果表明SCN4B在DU145細胞株中表達最低。選擇DU145細胞株進行轉染，與空白組進行對照，驗證了過表達SCN4B可抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲。

電壓門控鈉通道β亞基（由SCN1B至SCN4B 基因編碼）已被證明是調節細胞過程如細胞黏附和細胞遷移的重要多功能信號分子。HERNANDEZPLATA 等[10]和其他研究表明β4 亞基在一些細胞，腫瘤組織，和正常組織中表達有差異。SCN4B/β4亞基在宮頸癌細胞中的表達水平比正常的細胞表達水平低，但在活檢中結果卻相反，可能與其黏附功能在體內和體外條件不同有關。BON 等[9]的研究證明SCN4B/β4 亞單位在正常的乳腺癌上皮細胞和組織中表達，但在侵略性癌細胞和腫瘤中表達下降。SCN4B/β4的缺失通過RhoA 依賴性信號傳導途徑增強癌細胞遷移和轉移形成，獨立于成孔NaV 亞基。SCN4B 過表達減少了癌細胞侵襲和腫瘤進展，表明SCN4B/β4 代表抑制基因。GONG等[8]采用回顧性研究，通過生物信息學分析癌癥基因組圖譜（TCGA）表明：SCN4B的表達是乳頭狀甲狀腺癌無復發存活的獨立指標，同時還發現它的表達可能被DNA 高甲基化抑制，但不太可能受DNA 拷貝數改變/突變的影響。本研究與此相符，由此，筆者推測SCN4B的低表達影響了腫瘤的侵襲與轉移。

本文通過研究分析表明，SCN4B在前列腺癌中通過抑制腫瘤的增殖和侵襲發揮抑癌基因的作用，并對其診斷有重要意義。但是，這項研究也存在一些不足。首先，臨床標本樣本量相對較小。其次，SCN4B通過何種信號通路參與PCa的調控機制未涉及，以及裸鼠成瘤體內實驗的驗證。接下來將通過進一步的實驗探討SCN4B 與前列腺癌轉移之間的分子機制以及體內實驗的驗證。總之，本研究發現SCN4B在前列腺癌組織中低表達，而且，相對于SCN4B 高表達患者總體五年生存率降低。通過細胞功能實驗證明，過表達SCN4B可抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲。本研究對前列腺癌的診斷以及病情監測有一定意義。